王德堂，何 红，卢志刚

(荆楚理工学院 医学院，湖北 荆门 448000)

厚朴提取物厚朴酚与氟化物联合防龋的效果研究

王德堂，何 红，卢志刚

(荆楚理工学院 医学院，湖北 荆门 448000)

目的：通过建立动物模型研究厚朴提取物厚朴酚与氟化物联合预防龋病的效果，为研究新型防龋药物提供理论和试验依据。方法选用无特定病原体的SD大鼠接种国际标准株的变形链球菌，喂饲以Keyes研制的2000#致龋食物，分别用无菌蒸馏水、厚朴酚溶液、氟化钠溶液、氯己定溶液、厚朴酚与氟化钠混合液连续35 d给大鼠口腔局部涂药，采用Keyes龋病评分法及培养大鼠口腔内变形链球菌水平来评价不同处理方法对变形链球菌生长繁殖的影响并评估不同药物对大鼠龋病抑制的效果。结果抑制变形链球菌水平：氟化钠加厚朴酚组抑制致龋菌明显优于蒸馏水、氟化钠、厚朴酚、氯己定组(P<0.05)；氟化钠、厚朴酚及氯己定三组之间抑菌差异不显著(P>0.05), 氟化钠、厚朴酚及氯己定组抑菌优于蒸馏水组(P<0.05)；Keyes记分：光滑面和窝沟面E、Ds及Dm级龋损记分蒸馏水组与氟化钠、厚朴酚、氯己定及氟化钠加厚朴酚组都有显著差异(P<0.05)；光滑面Ds级记分，厚朴酚加氟化钠组记分为“0”，与厚朴酚、氟化钠和氯己定组有差别但不显著(P>0.05)；窝沟面Ds及Dm级龋损记分中，厚朴酚加氟化钠组与蒸馏水、厚朴酚、氟化钠和氯己定组有显著差异性(P<0.05)，厚朴酚、氟化钠和氯己定三组之间有差异但不显著。结论厚朴酚、氟化钠和氯己定单独使用均有较好的防龋作用，而厚朴酚与氟化物联合制剂联合防龋效果更佳，可明显减少大鼠龋病的形成及减轻龋损破坏程度，厚朴酚与氟化物联合防龋有一定的研究和应用价值。

厚朴酚；龋病；变形链球菌；Keyes龋病评分法

龋病是口腔常见病和多发病，WHO把它列为继心血管疾病和癌症之后的第三大重点防治疾病。含氟制剂是目前龋病预防常用的方法，能有效抑制致龋菌，促进牙齿再矿化，但氟制剂具有明显的局限性，如氟浓度的稳定性、过多或不当的使用引起氟中毒、不同地域之间环境含氟量不同造成氟制剂的有效浓度和安全剂量很难确定等。为此，国内外很多学者转向天然防龋药物的研究。

厚朴酚是厚朴的活性成分，现已证实能有效的抑制或杀死致龋菌，抑制效果与氟化物相当。与氟化物相比的优点是安全剂量大，副作用小，有研究证实不会引起肠道菌群失调，但其缺点是促进牙齿再矿化作用不明显，因此单独使用防龋效果也有限[1-2]。

本研究通过建立龋齿动物模型，将厚朴酚与氟化物联合应用，采用Keyes龋病评分等方法研究其防龋疗效，进而为龋病的防治寻找一种安全、有效和经济的药物。

1 材料和方法

1.1 仪器

体视显微镜；超薄型金刚砂片；电热恒温箱；厌氧培养箱；光学显微镜；压力蒸汽灭菌器。

1.2 试剂

厚朴酚(纯度>99%，南京广润生物制品有限公司)；氨苄西林胶囊(珠海联邦制药股份有限公司中山分公司)；氟化钠(纯度>99%，江西世龙实业化工股份有限公司)；氯己定(西安天正药用辅料有限公司)；采用变形链球菌亚群表兄链球菌6715(S.sobrinus6715)国际标准株(武汉大学口腔医学院口腔生物医学工程教育部重点实验室提供)；BHI血琼脂和MSB琼脂培养基[3]。

1.3 动物和饲料

无特定病原体SD大鼠(SPF-SD)100只，雌雄各半，由贵阳医学院实验动物中心提供，致龋食谱采用Keyes为小鼠和仓鼠致龋所配制的2000#食谱[2]。

2实验方法

2.1 药液配制

采用30%聚乙二醇400将厚朴酚配制成1 mg/mL的母液，滤过器过滤消毒将母液稀释到6.3 μg/mL；用蒸馏水将高纯度的氟化钠稀释成含氟化钠0.1 mg/mL溶液和含1.2 mg/mL(0.12%)氯己定溶液；将浓度为6.3 μg/mL的厚朴酚与0.1 mg/mL氟化钠溶液按1∶1的容积比配成复合制剂置于4 ℃的冰箱备用。

2.2 实验分组

本实验分为5组，分别为蒸馏水组(空白对照组)，厚朴酚与氟化钠混合组(实验组)，厚朴酚、氟化钠、氯己定组(阳性对照组)，每组20只SPF-SD大鼠。

2.3 龋病动物模型的建立[4]

选取18 d龄大的SPF-SD大鼠100只(雌雄各半)，均无龋齿。给予致龋饲料2000#喂养2 d，鼠龄20～22 d在饮水和普通饲料中分别加入氨苄西林(浓度分别为400 U/mL和4 mg/g)，23 d龄大鼠取口腔唾液观察抗生素抑菌效果，目的是为了杀灭大鼠口腔内原有的细菌后，进行S.sobrinus国际标准株的接种。

鼠龄24～28 d恢复给予致龋饲料2000#并持续至实验结束，并在大鼠牙面连续接种新鲜培养18 h的S.sobrinus6715，浓度为2×109菌落形成单位(CFU)/mL，每只鼠口腔用无菌棉签涂拭菌液200 μL，涂拭后2 h内禁食禁饮，间隔30 min后再接种1次。细菌接种前后(即鼠龄23 d和29 d)用无菌棉签随机采集20只大鼠口腔内牙菌斑样本，经稀释涂平板，37 ℃厌氧培养，检测细菌是否接种成功。鼠龄29 d对大鼠随机分组编号，64 d再次随机取20只大鼠牙菌斑，稀释后置于BHI血琼脂(记录总菌落数)和MSB琼脂(记录S.sobrinus菌落数)培养，求两者比值即S.sobrinus水平[5]。

自30 d开始用无菌棉签蘸取无菌蒸馏水、厚朴酚溶液、氟化钠溶液、氯己定溶液、厚朴酚与氟化钠混合液涂抹各实验组大鼠口腔黏膜及牙齿的各个面，为确保药液到位，每只大鼠用钝头注射器抽取1 mL药液注射于口腔保持10 s漱口，处理后2 h内禁食禁饮。

2.4 Keyes法对龋损分级评分

65 d后乙醚窒息处死大鼠，断颅，分离上下颌骨，去除软组织后将颌骨浸入2%氢氧化铵溶液中浸泡30 min，清洗干燥后置于0.4%的紫脲酸铵染液12 h后清水冲洗，室温自然干燥，用薄金钢砂片沿上、下颌磨牙近远中向矢状片切，清洗干燥后根据Keyes经典评分标准在体视显微镜下分别对每只鼠磨牙的光滑面和窝沟处牙釉质龋(E)、牙本质浅龋(Ds)、牙本质中龋(Dm)、牙本质深龋(Dx)进行评分，以此评定药物抑制龋病的情况。

2.5 统计处理

采用SPSS16.0统计软件包，对计量资料采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 S.sobrinus定植情况

在接种S.sobrinus前(即鼠龄23 d前)采集大鼠口腔内牙菌斑经MSB琼脂培养基培养后未见变形链球菌菌落，革兰染色和生化鉴定也未检出变形链球菌；接种S.sobrinus 3 d后(即鼠龄29 d)采集大鼠口腔内牙菌斑培养见培养基内大量S.sobrinus菌落，经革兰染色和生化鉴定为S.sobrinus，定植成功。64 d S.sobrinus水平变化见表1，实验组与阳性对照组和空白对照组之间相比有显著差异(P<0.05)，氟化钠、厚朴酚及氯己定组差异不显著(P>0.05)，氟化钠、厚朴酚及氯己定组与蒸馏水组有显著差异(P<0.05)。S.sobrinus水平的计算式为：

S.sobrinus水平[5]=(S.sobrinus菌落数/总菌落数)×100%

表1 鼠龄64 d大鼠牙菌斑中菌落数及S.sobrinus比值

3.2 大鼠龋损Keyes记分[5]

3.2.1 光滑面Keyes记分

具体记分结果见表2，在E级龋损记分中，除蒸馏水组与各组之间相比有明显的统计学意义(P<0.05)外，其余各组之间Keyes记分无统计学意义(P>0.05)；在Ds级记分中，厚朴酚加氟化钠混合液未检出，与蒸馏水组相比有统计学意义(P<0.05)，厚朴酚、氟化钠和氯己定组与蒸馏水组相比Keyes记分有所降低，但无统计学差异(P>0.05)，Dm和Dx级龋损仅蒸馏水组检出。

表2 光滑面龋损Keyes记分

3.2.2 窝沟龋损Keyes记分

外观观察各组磨牙交合面均有不同程度龋坏，具体记分结果见表3。E级龋损记分：蒸馏水组与其余各组相比有显著差异(P<0.05)； Ds及Dm级龋损记分中，厚朴酚加氟化钠组与蒸馏水、厚朴酚、氟化钠和氯己定组有显著差异(P<0.05)，厚朴酚、氟化钠和氯己定三组之间有差异但不显著(P>0.05)；在Ds级记分中，厚朴酚、氟化钠和氯己定组与蒸馏水组也有显著差异(P<0.05)；Dm级记分中，蒸馏水组与各组有显著差异(P<0.05)，阳性组之间无明显差异；Dx级龋损记分：厚朴酚加氟化钠组未检出，厚朴酚、氟化钠和氯己定三组与蒸馏水组比较有统计学差异(P<0.05)。

表3 窝沟面龋损记分

4 讨论

龋病是一种以细菌为主的多因素作用下的，牙体硬组织发生慢性进行性破坏的感染性疾病，2005年我国第三次口腔健康流行病学抽样调查结果显示5岁儿童乳牙患龋率为66%，12岁儿童恒牙患龋率为28.9%，35～44岁年龄组患龋率为88.1%，65～74岁患龋率为98.4%，龋病患病率之高，严重危害了人类口腔及全身健康[6]。目前，龋病的预防措施主要有口腔卫生保健、饮食控制、氟化物的应用、抗微生物药物和免疫防龋等综合途径。发现氟化物可以防龋是20世纪预防口腔医学对人类最大贡献之一，世界卫生组织(WHO)、世界牙科联盟(FDI)、国际牙科研究学会(IADR)在 2006年11月联合召开的“使用氟化物促进口腔健康全球专家大会”上，进一步强调使用氟化物来预防龋病是目前降低人群患龋率切实可行的方法。氟化物防龋的有效性已得到公认并被广泛接受，但这并不意味氟化物防龋就是理想方法，氟化物的使用也具有明显的局限性，例如氟浓度的稳定性难以维持、过多或不当的使用可引起急慢性氟中毒、不同地域之间环境含氟量不同造成氟制剂的有效浓度和安全剂量很难确定，人造氟斑牙、氟骨症难以避免等，20世纪七、八十年代广州饮用水加氟引起氟斑牙流行就是一次惨痛的教训。此外，含氟化产品的使用需要众多专业人士指导和实施，耗资巨大，同我国国情极不相符，更不适合我国龋病的群体性防治。抗微生物制剂如四环素、洗必泰虽然有较好的防龋效果，但由于它是一种广谱抗菌剂，长期使用易引起口腔菌群失调，使细菌产生耐药性，因此，应用抗生素防龋也受到极大的限制。免疫防龋面临着增强免疫原性以及人体应用的安全性问题，同时对口腔菌群生态影响的问题仍有待解决。因此，寻找安全、有效、经济的防龋药物是目前龋病防治研究的重点，于是广泛生存在自然界的天然药物进入口腔预防医学研究者的视野，目前厚朴提取物厚朴酚防龋成为了国内外研究的热点和重点。

早在80年代，日本学者Namba[7]等在对厚朴等180种生药进行筛选研究中发现，厚朴的提取物对变形链球菌有很强的抗菌作用，并对厚朴的主要化学成分厚朴酚及厚朴酚作药敏实验，测定其最低抑菌浓度(MIC)为6.3 μg/mL，而且2.5 min即可达到杀菌效果。四川大学冯谨[1]博士发现厚朴酚对变链菌的作用受蔗糖影响，而对变链菌的GTF酶活性并无抑制作用，认为厚朴酚的抗菌作用只是单纯的抑菌或杀菌。同期国内学者也证实了厚朴酚对致龋菌的抑杀作用，乌爱菊[2]等对不同厚朴提取物抑菌作用比较时发现，厚朴酚对变链菌的MIC为10 μg/mL，但对大肠杆菌抑制浓度在10 mg/mL以上，因此认为长期口服含厚朴酚的制剂对肠道正常菌群来说是安全的，提示厚朴酚作为抗龋药物具有良好的应用前景。近年来，国内外学者对厚朴酚抗龋的研究更深入到细菌致龋的毒力因子。李君等[8]研究厚朴酚对于溶液中及唾液包被的轻磷灰石(sHA)表面的变链菌GTF(葡萄糖基转移酶)酶活性的影响时发现，厚朴酚在浓度为1.25～5 mg/mL时能有效抑制溶液中以及吸附到sHA表面的GTF酶活性。黄冰冰等[9]研究发现厚朴酚能显著抑制GTF酶、a淀粉酶和a葡糖昔酶的活性，降低变链菌蔗糖依赖性及蔗糖非依赖性粘附，证明厚朴酚对GTF-I的抑制作用位点在GTF-I葡聚糖结合区，认为厚朴酚具有多方面的抗龋效果。同时冯谨[1]还首次实验证实厚朴的防龋有效成分对牙齿矿化没有明显的作用，而龋病的形成机制是致龋菌在代谢过程中产酸，导致局部牙体硬组织脱矿，轻磷灰石晶体溶解破坏，无机钙、磷移出所致。由于其促进牙齿再矿化作用不明显，因此单独使用防龋效果也有限。

介于氟化物与厚朴提取物单独使用防龋各自有其优缺点，本研究意在探索能否将两者配制成复方制剂，相互取长补短，研制出一种新型、安全、经济、有效及适合所有人群使用的防龋产品。从本次研究的结果发现，在动物模型中鼠龄64 d时采集大鼠牙菌斑进行细菌培养后进行S.sobrinus菌落计数和S.sobrinus水平分析发现，在抑制S.sobrinus方面，厚朴酚加氟化钠组明显优于其他组，显示出具有协同效应的效果；同时氟化钠、厚朴酚、氯己定组与蒸馏水组比较，也显示出氟化钠、厚朴酚、氯己定单独使用有其较强的抑制致龋菌的能力，且三者之间差异不显著，实验验证厚朴酚与氟化钠联合使用比单独使用在抑制致龋菌方面效果更好。

大鼠磨光滑面和窝沟龋损Keyes记分分析，Keyes评分法直观、客观，能准确反应龋损的破坏程度，具有实际应用价值。光滑面Keyes记分方面，E级龋损蒸馏水组与其余各组有统计学差异，其余各组之间以厚朴酚与氟化钠组记分最低，但无统计学差异。Ds级记分厚朴酚加氟化钠制剂组为“0”；窝沟龋分级Keyes记分中，厚朴酚加氟化钠仅在E和Ds级检出，Dm和Dx级都未检出且与各组间有统计学意义，实验说明，厚朴酚与氟化钠联合应用防龋能力有所提高。

关于阳性对照组药物及药物浓度选择的理论基础、实际应用价值和科学性的说明。氟化物防龋效果是目前已公认的，其抗龋机制是抑制致龋菌代谢生长、减少牙菌斑内酸的形成、降低牙釉质溶解度及促进牙釉质再矿化，但对细菌的作用需要依赖药物浓度，浓度过低不起作用，过高又容易引起氟中毒，为此国内外的很多学者对氟化物的药用浓度进行了研究，公认的对致龋菌作用的浓度是在10 μg/mL时抑制细菌代谢，在0.1～0.25 mg/mL可以抑制细菌生长，当浓度达到1 mg/mL时可以杀死细菌[10]；氯己定系二价阳离子表面活性剂，是目前已知杀菌能力最强、最有效的化学抑制菌斑剂，对革兰氏阳性和阴性及真菌都有杀菌作用，故药效学研究中常用它来作为阳性对照和金标准来评价其他抗菌药，目前临床上常用0.12%～0.2%浓度的溶液预防和治疗口腔疾病；厚朴酚在前文已述；本研究药物浓度均选择MIC，主要是为避免由于药物浓度过高，使实验结果失真。

本研究初步证实了厚朴提取物厚朴酚与氟化物联合防龋可提高预防龋病的效果，其所期待解决的问题及不足，一是该研究虽然显示厚朴酚与氟化钠联合防龋效果优于单独使用，但其产生的效应是否系二者具有协同效应还有待于进一步研究证实；二是动物模型毕竟不同于人，人的口腔环境及人体免疫机能都与大鼠有很大差异，将该研究方法在人体进行实验是否具有相同的结果还需要进一步设计验证。

[1] 冯谨.天然药物厚朴防龋作用的药效学研究[D].成都:四川大学,2007.

[2] 乌爱菊,翁方敏,邵家环,等.中药厚朴的防龋研究——厚朴活性成分的抗菌作用[J].口腔医学,1983,3(3):115-126.

[3] 李美加,王丽,史艳芬,等.橙皮苷防龋作用的动物实验研究[J].实用口腔医学杂志,2014,30(5):1-6.

[4] 王松灵.口腔分子生物学与口腔实验动物模型[M].北京:人民卫生出版社,2011.

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[9] 黄冰冰,樊明文.天然植物药的防龋研究进展[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2002,12(10):574-576.

[10] 卞金友.口腔预防医学[M].北京:人民卫生出版社,2011.

2014-07-10

荆楚理工学院校级科研项目(ZR201106)

王德堂(1979-)，男，贵州江口人，荆楚理工学院讲师，硕士。研究方向：口腔预防医学； 何红(1971-)，女，湖北荆门人，荆楚理工学院副教授，硕士。研究方向：口腔医学； 卢志刚(1975-)，男，湖北京山人，荆楚理工学院副教授，博士。研究方向：中医中药学。

R285.5

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1008-4657(2014)04-0067-05

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