卢萍平，邢 凤*，刘博丹，梁志鹏

(1.塔里木大学 动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300)

科学研究

Lin28B基因表达与绵羊初情期启动的关系研究

卢萍平1,2，邢 凤1,2*，刘博丹1,2，梁志鹏1,2

(1.塔里木大学 动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300)

初情期是家畜从不能繁殖到获得繁殖能力的标志，是雌性动物发育过程中的一个关键阶段。研究以性早熟的多浪羊和性晚熟的和田羊为研究对象，对其Lin28B基因外显子3进行克隆，采用Real-time PCR技术分析Lin28B基因在多浪羊和和田羊幼年期、初情期下丘脑、卵巢中表达变化，结果显示多浪羊和和田羊Lin28B基因外显子3序列相同，多浪羊下丘脑和卵巢中Lin28B基因mRNA表达量在初情期时低于幼年期(P<0.05)；和田羊卵巢Lin28B基因mRNA表达量在初情期时低于幼年期(P<0.05)。研究结果表明,Lin28B基因表达下调与初情期启动呈正相关，该研究对于揭示Lin28B基因在绵羊初情期启动中的作用及机制提供了科学依据。

多浪羊；Lin28B；初情期；荧光定量PCR

Lin28是一种高度保守的RNA结合蛋白，最早发现于秀丽隐杆线虫中，是调节线虫发育时间的异时基因[1]。在哺乳动物中，该基因的同源基因有两种，Lin28A和Lin28B。已在人和小鼠等多种哺乳动物中鉴定出Lin28B基因[2]，山羊Lin28B基因现已被克隆出来，cDNA序列全长为5 353 bp，包括744 bp编码区和4 410 bp的3′ UTR[3]。近年来利用全基因组关联分析(GWAS)、转基因等研究发现Lin28B基因在人青春期及小鼠、山羊等哺乳动物初情期启动中具有重要调节作用[3,4-8]。在哺乳动物幼年期到初情期的发育过程中，下丘脑、垂体、卵巢中Lin28B基因表达显著下降，从而初情期启动。Grieco等[7]研究发现，与20 d C57BL/6(B6)小鼠相比，25 d、30 d和初情期后C57BL/6(B6)小鼠卵巢中Lin28B基因mRNA表达显著下降；Sangiao-Alvarellos等[8]研究发现Lin28B基因mRNA在新生雌、雄大鼠下丘脑中大量表达，在幼年期到初情期的过渡中，表达急剧下降。目前对Lin28B基因在绵羊初情期启动中表达及作用研究还未见报道。多浪羊是新疆的一个优良肉脂兼用型地方绵羊品种，据《新疆家畜家禽品种志》[9]记载，多浪羊具有生长发育快、有宝贵的早熟性和多胎性、产肉性能好、遗传性稳定等优点，早熟性尤其突出，4～5月龄达到初情期，6～8月龄可初配；和田羊是新疆特有的短脂尾异质半粗毛羊，性晚熟，初情期较晚，大约1.5岁初配；多浪羊和和田羊为研究绵羊初情期启动机制提供了宝贵的材料。本研究以性早熟的多浪羊和性晚熟的和田羊为研究对象，对Lin28B基因外显子3进行克隆，采用Real～time PCR技术分析Lin28B基因在多浪羊和和田羊下丘脑、卵巢中表达变化，为揭示Lin28B基因在绵羊初情期启动中的作用及机制，培育性早熟的绵羊品种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验动物和样品采集 试验分别选用多浪羊和和田羊母羊各12只，其中幼年期(30日龄)各6只，初情期多浪羊(4月龄)、和田羊(10月龄)各6只。采集下丘脑、卵巢组织2 g置于DEPC水处理的1.5 mL EP管中，并立即投入液氮中冷冻备用。

1.1.2 主要试剂 Taq DNA聚合酶，DNA Marker、dNTP、SYBR Premix Ex TaqⅡ定量试剂盒，凝胶回收试剂盒等。

1.2 方 法

1.2.1 总RNA提取 Trizol一步法提取下丘脑、卵巢组织中的总RNA，利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，然后利用紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度。

1.2.2 反转录合成cDNA 反转录按照试剂盒的要求进行：首先混合总RNA 2 μL(约2 μg)，oligo (dT)18(0.25 μg/μL)2 μL，dNTPs (2.5 mmol/μL) 2 μL和RNase free H2O 7μL，然后65 ℃ 5 min，冰浴2 min，再加入5×First-Strand Buffer 4 μL，DTT(0.1 mol/L) 1 μL，RNase inhibitor(40 U/μL)1μL，SuperscriptTMⅢ 反转录酶(200 U/μL)0.6 μL，最后加RNase free H2O水补足总体积到25 μL。按照55 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min进行反转录，RT产物-20 ℃保存备用。

1.2.4 引物合成和RT-PCR扩增、克隆测序Lin28B基因引物序列参考文献[10]，引物F1: 5′-G CATATTATTCATGGAAGGAT-3′，R1: 5′-CGT TTGGTTTTCTTTTTTGT-3′，对多浪羊和和田羊下丘脑和卵巢中Lin28B基因外显子3进行扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，然后用DNA回收试剂盒回收，连接pMD18-T载体，转化大场杆菌DH5a感受态细胞，挑取3个阳性克隆进行培养，送往上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.2.5 实时荧光定量PCR(Real time PCR)Lin28B基因实时荧光定量引物同1.2.4中的引物，以持家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参，内参引物参考文献[11]，引物序列为：F: 5 ′-AAGTTCCACGGCACAGTCAA-3′，R: 5′-ACCACATACTCAGCACCAGC-3′。反应体系包括cDNA 0.5 μL，H2O 3.95 μL，2×Brilliant®Ⅱ SYBR®Green QPCR Master Mix 5 μL，引物0.1 μL，Rox 0.15 μL。反应程序为 95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，50.0 ℃30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃读板(plate read)，35个循环。每个样品3个重复，用2-△△Ct的方法[12]计算基因的表达水平，确定基因的表达丰度。

1.2.6 数据分析

用 SAS 9.2软件数据进行方差分析，用Duncan法进行多重比较，数据结果用“平均数±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取

对采集的下丘脑、卵巢组织提取总RNA，用紫外分光光度计对所取得的总RNA样品稀释后测其OD260及OD280值，OD260/OD280在1.8～1.9之间，适合进行下一步的试验。总RNA的凝胶电泳结果显示清晰的28S与18S条带，同时还可以看到5S条带。

2.2 Lin28B基因外显子3扩增结果

对多浪羊下丘脑、卵巢中Lin28B基因表达情况进行RT-PCR检测，结果如图1所示，Lin28B基因在绵羊下丘脑和卵巢中均有表达，片段大小为177 bp，引物的特异性较好。

图1初情期多浪羊下丘脑、卵巢RT-PCR检测结果
M.ML2000；1.卵巢；2.下丘脑
Fig.1 RT-PCR ofLin28Bgene in hypothalamus and ovary of Duolang sheep on puberty
M.ML2000；1.ovary;2.hypothalamus

2.3 多浪羊与和田羊 Lin28B基因外显子3序列比对结果

对多浪羊与和田羊Lin28B基因外显子3进行了RT-PCR扩增，并对扩增产物进行克隆测序，利用DNAman对序列进行比对结果见图2。由图2可知，多浪羊和和田羊序列的同源性为100%，多浪羊与NCBI Genbank中绵羊Lin28B基因外显子3序列(JQ277701.1)的同源性为98.31%，与牛Lin28B基因外显子3序列(XM_002707838.3)的同源性为98.87%。

2.4 实时荧光定量PCR 扩增结果

利用实时荧光定量PCR技术，对多浪羊与和田羊幼年期及初情期下丘脑、卵巢中Lin28B基因 mRNA表达情况进行了分析结果见表1。由表1可知，多浪羊下丘脑和卵巢中Lin28B基因mRNA表达量在初情期低于幼年期(P<0.05)；和田羊卵巢Lin28B基因mRNA表达量在初情期低于幼年期(P<0.05)，和田羊下丘脑中Lin28B基因mRNA表达量初情期低于幼年期，但差异不显著(P>0.05)；由此可知，在幼年期至初情期的过渡过程中，多浪羊下丘脑和卵巢中Lin28B基因mRNA表达均下降，和田羊卵巢中Lin28B基因mRNA表达下降。

图2 绵羊、牛Lin28B基因外显子3序列比对结果Fig.2 Alignment of the nucleotide sequences of Lin28B gene of Duolang sheep and Hetian sheep with those of sheep(JQ277701.1)and cattle(XM_002707838.3)

表1 Lin28B基因在多浪羊、和田羊下丘脑、卵巢中的表达量Table 1 Expression quantity of Lin28B gene in hypothalamus and ovary

注：同列不同字母表示差异显著。

Notes:Offerent supersiripts in the same row indicate significant difference.

3 讨 论

3.1 Lin28B基因序列比对结果

本研究对测序得到的多浪羊、和田羊Lin28B基因序列与NCBI Genbank中绵羊、牛的Lin28B基因序列进行了同源性比较，结果发现多浪羊和和田羊序列同源性为100%，多浪羊与绵羊同源性为98.31%，与牛的同源性为98.87%，说明Lin28B基因在进化的过程中具有较高的保守性。

3.2 关于Lin28B基因的表达分析

人和哺乳动物正常的初情期是下丘脑-垂体-性腺轴准确发动的结果[13-14]。研究发现,Lin28B基因主要在繁殖相关的组织如下丘脑、垂体、卵巢、睾丸中表达量较高，在下丘脑-垂体-性腺轴(HPGA)均有分布，是其参与初情期启动和繁殖调控的结构基础[8,15]。本研究发现Lin28B基因在多浪羊和和田羊下丘脑和卵巢中表达量较高，由此可推测Lin28B基因在绵羊初情期启动和繁殖活动中具有重要调节作用。

3.3 Lin28B基因与绵羊初情期启动的关系

Cao等[3]报道山羊Lin28B基因内2934和3053位点与山羊初情期启动有关，Lin28B基因是调控山羊初情期启动的重要基因。对性早熟的多浪羊和性晚熟的和田羊Lin28B基因外显子3进行了克隆，发现它们的序列相同，多浪羊Lin28B基因多态性是否与初情期启动具有相关性，我们将在后续试验中进一步研究。

本研究发现多浪羊初情期下丘脑Lin28B基因mRNA表达低于幼年期，而和田羊初情期下丘脑中Lin28B基因表达量低于幼年期，但没有达到显著水平，这也许是多浪羊初情期比较早的原因之一，将在后续试验中对此进一步深入研究。前人研究发现猴、小鼠、大鼠Lin28B基因在下丘脑、卵巢中的表达呈发育性变化，且在初情期时的表达量明显下降，初情期启动[7-8,16]。本研究发现多浪羊在幼年期到初情期的过渡过程中，下丘脑和卵巢中Lin28B基因mRNA表达下降，因此推测Lin28B基因在绵羊初情期启动中具有重要作用。

4 结 论

Lin28B基因表达下调与初情期启动呈正相关，该研究对于揭示Lin28B基因在绵羊初情期启动中的作用及机制提供了科学依据。

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Lin28BGeneExpressionanditsRoleintheOnsetofPubertyofSheep

LU Ping-ping1,2,XING Feng1,2*,LIU Bo-dan1,2,LIANG Zhi-peng1,2

(1．CollegeofAnimalScience,TarimUniversity,Alar,XinJiang843300,China;2．KeylaboratorylofTarimAnimalHusbandryScienceandTechnology,XinJiangProduction&ConstructionCorps,Alar,Xinjiang843300,China)

Puberty of animals marked their fertility and is a key stage in female animal development.Precocious sheep breed,Duolang sheep,and late-maturing sheep breed,Hetian sheep were selected as subjects in the study,the exon 3 of Lin28B gene of the selected animals were cloned,and the real-time PCR technology was used to examine the mRNA expression level of Lin28B gene in the hypothalamus and ovary of juvenile stage and pubertal stage.The results showed the sequences alignment of Lin28B exons 3 of Duolang sheep and Hetian sheep were the same;the expression level of Lin28B gene in the hypothalamus and ovary were significantly lower than that in juvenlie period of Duolang sheep(P<0.05),the expression level of Lin28B gene in the ovary was significantly lower than that in the juvenlie period of Hetian sheep(P<0.05).The results indicated that the down-regulated expression of Lin28B gene was positively correlated with the onset of puberty in sheep.The study can help to provide a scientific basis for revealing the effect and mechanism of Lin28B gene in the onset of puberty in sheep.

Duolang sheep;Lin28B;puberty;qPCR

2014-04-29，

2014-06-03

塔里木大学校长基金项目(TDZKBS20103)；国家大学生创新创业训练计划项目(2014024)

卢萍平(1991-)，女，甘肃通渭人，本科，研究方向：动植物检疫。E-mail:1530633340@qq.com

*[通讯作者]邢 凤(1981-)，女，山东曹县人，副教授，博士，主要从事动物遗传育种与繁殖研究。E-mail: xingfeng2001@126.com

S811.6

A

1005-5228(2014)09-0014-04