于艳艳，丁 甜，刘东红

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州310058)

嗜冷菌是指在7℃及以下可生长的微生物［1］，其种类繁多，在原料乳中最常见的嗜冷菌是革兰氏阴性的假单胞菌属(Pseudomonas)和革兰氏阳性的杆菌属(Bacillus)。嗜冷菌对原料乳品质和货架期有很大影响，挤奶设备的不彻底清洗和消毒被认为是引起嗜冷菌污染的主要原因之一［2］。虽然嗜冷菌在巴氏杀菌和UHT灭菌阶段能够被完全杀死，但是其在生长繁殖过程中产生了热稳定性的蛋白酶和脂肪酶，这些酶在热处理之后仍能残留一定活性，在乳制品储藏过程中不断分解蛋白质和脂肪，最终导致乳制品出现苦味、腐烂味等风味异常［3］。此外，某些嗜冷菌属能够产生毒素或者具有抗药性而被认为是机会致病菌［4］。因此，嗜冷菌污染是影响乳品工业发展的重要因素，快速准确地检测原料乳中嗜冷菌含量对提高乳制品品质，加强企业经济效益有战略意义。

国际标准中嗜冷菌的测定方法是将原料乳在6.5℃下培养10d计数，该方法能够准确计数但是耗时过长。随着微生物技术的不断发展，化学方法、免疫技术、分子基因技术、物理方法等技术被应用到微生物的快速检测中，其中大都适用于乳制品微生物的检测。这些新兴技术的出现大大缩短了检测时间，为乳制品企业及时有效地了解乳中嗜冷菌含量提供了依据。

1 嗜冷菌快速检测方法

国内外对嗜冷菌的快速检测建立了许多方法(见表1)，这些方法不断被优化改进以求达到工业化应用的目的。然而刚采集的新鲜原料乳中初始嗜冷菌占细菌总数的10%～50%，在低温冷藏过程中再逐渐占据主导地位［5］。一些快速检测方法(如氨肽酶法、电阻抗法、ELISA、QCM等)检测阈值较高，菌数达到104cfu/mL以上才能被检出，不能第一时间得到新鲜生乳中的嗜冷菌含量。DEFT法近些年来少有报道，且在103cfu/mL以上才有较好线性关系。而脂肪酶活法受到乳中游离脂肪酸等因素影响，与嗜冷菌的相关性仍有待研究。

因此，本文将重点介绍其中几种近些年来发展较快，低检测阈值且快速省时的嗜冷菌检测技术。

1.1 实时定量PCR

实时定量 PCR(Real－timeQuantitative Polymerase Chain Reaction，RQ－PCR)是在常规 PCR体系中加入荧光染料或荧光探针，实现对PCR反应过程的实时监测和累加荧光信号的同步分析，从而克服了传统PCR只能基于凝胶电泳定性判断的缺点。很多研究表明该方法检测限与平板计数法相近，例如对原料乳中类芽孢杆菌属(Paenibacillus spp.)定量分析，其检测限约为3.25 ×101cfu/mL［12］;而对污染奶样中单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的 PCR 定量检测限可达1.58 ×103cfu/mL［13］。

表1 主要几种嗜冷菌快速检测技术Table 1 Several major rapid detection methods of psychrophilic bacteria

目前RQ－PCR趋于更加节约时间和成本，在单一反应中进行复合 PCR扩增成为研究趋势［14］。Machado等人［15］针对不同目标基因设置了各自的特异性引物，对原料乳中不动杆菌属(Acinetobacter)，荧光假单孢菌属(P.fluorescens)，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和沙雷氏菌(Serratia)进行复合PCR探索分析，凝胶电泳结果可清晰区分4条不同长度的DNA链，表明在原料乳中同时检测这四种细菌的可操作性。实时的复合PCR技术通常采用含有不同荧光素的特异性探针在扩增时进行同步监测，而荧光染料不能特异性区分不同DNA片断，需通过后续的融化曲线分析来克服此问题［16］。Omiccioli等人［17］比对了荧光探针复合PCR和融化曲线分析两种方法来同时检测奶样中沙门氏菌(Salmomella spp.)、单增李斯特菌和大肠杆菌O157(Escherichia coli O157)，结果显示虽然荧光探针复合PCR在检测培养基样品时更为灵敏，但两种方法在对奶样检测时达到了同样的检测限:1cfu/125mL。这种技术的出现为原料乳中多种优势嗜冷菌属的同步检测奠定了基础，比对单一菌属的测定来反映嗜冷菌总数更具准确性。

但是RQ－PCR无法区分样品中的DNA是来自活细胞还是死细胞。目前的解决方式是在DNA提取和扩增前先加入一种染料［18］，在该技术中染料EMA或PMA只能进入死细胞破坏其细胞完整性和DNA结构，从而抑制死细胞DNA的扩增。

1.2 环介导等温扩增

环介导等温扩增技术(Loop－mediated Isothermal Amplification，LAMP)是针对目的基因的六个区域设计四条特异性引物，利用一种具有链置换特性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下反应几十分钟快速扩增靶序列［19］。与PCR技术相比，这种技术不需要专用的实验设备，在简单的加热仪器中就能进行，并且由于四条引物必须与六个靶基因准确杂交才能开始DNA合成，因此该技术具有极高的特异性［20］，例如Wang［21］等采用LAMP技术对原料乳中单增李斯特菌的检测，且在没有增菌培养的情况下与标准方法的检测一致性高达91.67%，经过增菌处理后能达100%一致性。

研究表明，在DNA合成阶段产生的焦磷酸镁衍生物沉淀所引起的体系浊度变化与目标基因的扩增数呈线性关系［22］，因此可以通过监控体系的浊度变化来间接推算样品中目标基因的含量，从而实现对样品中菌数的定量分析。Shan等［23］就使用实时浊度分析仪定量检测了食品中单增李斯特菌的hlyA基因，得到浊度阈值和菌浓度对数值之间的线性相关性为0.991，其最低检测限可达6cfu/管。此外，微流控芯片技术的出现使LAMP技术的操作变得更为便捷省时。Tourlousse［24］使用这种技术成功检测到了沙门氏菌、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)等4种菌属的目的基因，并在体系中加入了荧光染料，通过荧光分析仪的实时监控同样达到了对菌数定量检测的目的，该反应能在20min内检测到每1μL中10～100个基因的浓度，这种微流控芯片结合实时荧光分析设备的低成本复合体系将来可能成为现场嗜冷菌快速检测的重要方式之一。

当然，这种灵敏度高、反应时间短的技术也存在一定缺点:由于LAMP是链置换合成，一般建议其扩增区域距离为120～180bp，超过500bp的长链靶序列则难以扩增。

1.3 荧光原位杂交

荧光原位杂交技术(FluorescenceInSitu Hybridization，FISH)是通过已知外源的荧光标记寡核苷酸作为探针，基于碱基互补原则，与待检测的染色体或DNA纤维切片上的靶序列专一性结合，通过检测杂交位点的荧光信号来对特定核苷酸序列进行定性、定量和定位分析［25］。与前两种技术不同的是，FISH不需要核酸提取或扩增的过程，因而被认为是快速检测食品中微生物的重要方法之一。牛奶中嗜冷菌属检测方面，Kitaguchi［26］等人使用 16s rRNA 的寡核苷酸探针结合CTC染料染色在6h内检测牛奶中假单胞菌属，与实际菌数的相关性可达0.99，该方法采用荧光显微镜人工计数，较为耗时耗力，引入自动化的图像分析仪器更有助于实验的快速进行［27］。另一方面，肽核酸探针比寡核苷酸探针的杂交速度更快［26］，例如采用Lac663肽核酸探针检测牛奶中乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)时大约需要 3h［28］，具有更广阔的应用前景。

随着 FISH的发展，多色荧光原位杂交技术(multicolor fluorescence in situ hybridization)逐渐被应用到食品中不同菌属的同步检测中，这种技术可利用不同荧光素标记的DNA探针对不同靶DNA同时进行分析。Yamaguchi［29］等人使用该技术在7h内完成了牛奶中肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和假单胞菌属的选择性分析，他们结合一种小菌落计数的方法，快速测定样品中目标细菌，得到了与平板计数法几乎一致的结果，其检测阈值可达2×103cells/mL，这为利用FISH技术在牛奶中复合检测多种嗜冷菌属提供了思路。

FISH技术也存在一定的缺点，例如在染色体含量较低的情况下，荧光信号的减弱会导致出现假阴性结果，因此要通过某些标记如生物素等来增强荧光信号。此外，杂交探针的设计也十分关键，特异性不足会导致实验出现假阳性的结果。

1.4 流式细胞术

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是以流式细胞仪为工具，将悬浮液中的待测细胞荧光染色后，被染色细胞受强激光照射，产生光信号，经一系列光电分析器接收分析后转换成数学信号［30］。这种技术同样不需要DNA的提取和扩增过程，且具有快速、灵敏、分析量大等优点，在乳制品微生物的快速检测中有着良好的应用。研究表明这种技术与传统平板法之间具有较好的相关性:Cassoli［31］等对原料奶中细菌总数的研究结果显示奶样低温储藏24、48和72h后两种方法的相关性分别大于0.82、0.87和0.91，并且不同时段采集的奶样对结果没有影响。与此同时，在奶制品中特定菌属的检测中，Flint［32］使用BactiFlow流式细胞仪检测了奶粉中嗜热菌的含量，样品经去除干扰因子，55℃保温等处理后检测结果和与平板培养法的相关系数可高达0.9748，可见两种方法得到的结果已十分相近，其最低检测限为103cfu/g。

此外，将流式细胞技术与其他一些高新技术结合也可得到很好的效果。Yamaguchi［33］等采用了一种微流体装置——芯片流体分析并结合原位杂交技术来特异性检测牛奶中假单胞菌属，结果发现该方法能检测到少于10cfu/mL的菌浓度，灵敏度高于平板培养。该方法需要约12h的增菌培养过程，总检测时间大约16h。Ikeda［34］等采用类似的方法测定牛奶中的李斯特菌数，其检出限为102cfu/mL，检测时间仅为5h。

FCM检测也受到多种因素的影响。由于乳中蛋白质、脂肪球等大颗粒物质的存在，会干扰流式细胞仪对目标细胞的定位，因此在乳品分析时首先将这些物质清除。此外，荧光染料的选择、细菌种类、细胞着色过程等也对其精度有一定影响。

1.5 ATP生物发光技术

ATP生物发光技术(Adenosine Triphosphate Bioluminescence)是将荧光素和微生物体内ATP在荧光素酶E和Mg2+的作用下形成复合体，该复合体被分子氧氧化发生电激发，最后发射光［35］。由于一定生理时期的微生物体内ATP的含量是相对稳定的，而光信号与ATP量成正比，通过测定光信号就能得到ATP含量。这种方法能在几分钟内完成检测，且灵敏度高，重复性好，可作为食品工业中一般危害分析和 HACCP 的一部分［36］。

初始采用ATP生物发光法对原料乳中细菌数检测时与标准平板法的相关性较低，这是由于乳中一些非微生物ATP(体细胞ATP、酪蛋白胶束上的游离ATP)的存在会干扰ATP检测的精度，一些学者就通过一些前处理手段破坏这些非微生物ATP。李春艳［37］等在反应体系中添加了体细胞裂解液，该方法与平板培养法之间的相关系数提高到0.9485。Wu［38］则通过二次离心和三磷酸腺苷双磷酸酶预处理来降低液态益生菌产品中其他物质的干扰，实验结果表明，当去除了这些干扰因子，ATP生物发光法与平板培养法之间没有显著差别，该方法能在30min内完成检测，其最低检测限为103cfu/mL。

目前一些研究趋于将ATP生物发光技术与其他技术结合以达到特异性检测某些菌属的目的。例如Cheng等［39］用生物磁性纳米微粒(BMNPs)与ATP生物发光技术结合快速检测巴氏杀菌乳中大肠杆菌含量。BMNPs的作用在于特异性结合到大肠杆菌表面使之轻易从样品中分离。该方法能在1h内完成检测，其检测限为20cfu/mL。这种快捷且具有特异性的方式为ATP生物发光技术特应用到特异性检测乳中优势嗜冷菌中指明了新的方向。

2 展望

嗜冷菌的快速检测技术为乳制品企业及时了解原料乳中嗜冷菌污染情况提供了有力帮助，这些反应灵敏、能检测到低浓度菌含量的高新技术更是拓宽了检测信息的广度。实时定量PCR、LAMP、FISH等技术虽然只能检测一种或几种菌群，但对优势菌群的定量分析能快速判断嗜冷菌的污染情况。流式细胞术能同时实现多个样的处理，满足现场大量样品的检测需求。ATP生物发光法是一种即时反应技术，能迅速得到结果。然而这些技术大都成本较高，且在提取目标物、设计引物等技术上比较繁复，在投入工业化使用的过程中存在一定的局限性，还需要在技术及设备上加强改进。

当前我国乳品安全是社会公众关注的热点话题，确保原料的安全卫生是乳制品企业收获更好的经济效益的关键之一，这为原料乳快速检测技术的发展提供了良好的契机。然而一些方法能在实验室得到很好的结果但未必适合工业化的应用，一种好的嗜冷菌检测技术应当具备灵快速、灵敏度高且成本低廉等优点，能在工厂环境下实现现场快速准确的检测，这就需要在成熟的技术基础上开发相应操作简便的检测设备，类似微流控芯片的出现。随着现代技术的不断发展以及对工业化技术应用的不断改进，原料乳中嗜冷菌的快速检测技术也能进一步朝着这样的方向发展。

［1］Champagne C P，Laing R R，Roy D，et al.Psychrotrophs in dairy products:their effects and their control［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，1994，34(1):1－30.

［2］陈历俊.原料乳生产与质量控制［M］.北京:中国轻工业出版社，2008:214

［3］Hantsis－Zacharov E，Halpern M.Culturable psychrotrophic bacterial communities in raw milk and their proteolytic and lipolytic traits［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73(22):7162－7168.

［4］Samarzija D，Zamberlin S，Pogacic T.Psychrotrophic bacteria and their negative effects on milk and dairy products quality［J］.Mljekarstvo，2012，62(2):77－95.

［5］Magan N，Pavlou A，Chrysanthakis I.Milk－sense:a volatile sensing system recognises spoilage bacteria and yeasts in milk［J］.Sensors and Actuators B－Chemical，2001，72(1):28－34.

［6］Pettipher G L，Mansell R，Mckinnon C H，et al.Rapid membrane filtration－epifluorescent microscopy technique for direct enumeration of bacteria in raw－milk［J］.Applied and Environmental Microbiology，1980，39(2):423－429.

［7］Manzano S，Antonio Ordónez J，Delahoz L，et al.A rapid method for the estimation of the microbiological quality of refrigerated raw milk based on the aminopeptidase activity of gram－negative bacteria［J］.International Dairy Journal，2005，15(1):79－84.

［8］Firstenberg－Edenr，Tricarico M K.Impedimetric determination of total，mesophilic and psychrotrophic counts in raw milk ［J］.Journal of Food Science，1983，48(6):1750－1754.

［9］Gutierrez R，Gonzalez I，Garcia T，et al.Monoclonal antibodies and an indirect ELISA for detection of psychrotrophic bacteria in refrigerated milk［J］.Journal of Food Protection，1997，60(1):23－27.

［10］任静，张兰威.原料乳中嗜冷菌的检测［J］.食品工业科技，2007，28(3):217－221.

［11］Bovenizer J S，Jacobs M B，O ＇sullivan C K，et al.The detection of pseudomonas aeruginosa using the quartz crystal microbalance［J］.Analytical Letters，1998，31(8):1287－1295.

［12］Ranieri M L，Ivy R A，Mitchell R，et al.Real－ time PCR detection of Paenibacillus spp in raw milk to predict shelf life performance of pasteurized fluid milk products［J］.Applied and Environmental Microbiology，2012，78(16):5855－5863.

［13］Dadkhah H，Bassami M R，Hashemi S，et al.Evaluation and comparison of SYBR Green I real－ time PCR and TaqMan realtime PCR methods for quantitative assay of Listeria monocytogenes in nutrient broth and milk［J］.African Journal of Microbiology Research，2012，6(9):1908－1917.

［14］Postollec F，Falentin H，Pavan S，et al.Recent advances in quantitative PCR(qPCR)applications in food microbiology［J］.Food Microbiology，2011，28(5):848－861.

［15］Machado S G，Bazzolli D，Vanetti M.Development of a PCR method for detecting proteolytic psychrotrophic bacteria in raw milk［J］.International Dairy Journal，2013，29(1):8－14.

［16］Wehrle E，Didier A，Moravek M，et al.Detection of Bacillus cereus with enteropathogenic potential by multiplex real－time PCR based on SYBR green I［J］.Molecular and Cellular Probes，2010，24(3):124－130.

［17］Omiccioli E，Amagliani G，Brandi G，et al.A new platform for real－ time PCR detection of Salmonella spp，Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk［J］.Food Microbiology，2009，26(6):615－622.

［18］Boyer M，Combrisson J.Analytical opportunities of quantitative polymerase chain reaction in dairy microbiology［J］.International Dairy Journal，2013，30(1):45－52.

［19］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop－mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Research，2000，28(12):e63.

［20］Niessen L，Luo J，Denschlag C，et al.The application of loop－mediated isothermal amplification(LAMP)in food testing for bacterial pathogens and fungal contaminants［J］.Food Microbiology，2013，36(2):191－206.

［21］Wang D G，Huo G C，Ren D X，et al.Development and evaluation of a loop－mediated isothermal amplification(LAMP)method for detecting Listera monocytogenes in raw milk［J］.Journal of Food Safety，2010，30(2):251－262.

［22］Mori Y，Nagamine K，Tomita N，et al.Detection of loopmediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2001，289(1):150－154.

［23］Shan X X，Zhang Y Q，Zhang Z G，et al.Rapid detection of food－borne Listeria monocytogenes by real－time quantitative loop－mediated isothermal amplification［J］.Food Science and Biotechnology，2012，21(1):101－106.

［24］Tourlousse D M，Ahmad F，Stedtfeld R D，et al.A polymer microfluidic chip for quantitative detection of multiple water－and foodborne pathogens using real－time fluorogenic loop－mediated isothermal amplification［J］.Biomedical Microdevice，2012，14(4):769－778.

［25］陈瑛，任南琪，李永峰，等.微生物荧光原位杂交(FISH)实验技术［J］.哈尔滨工业大学学报，2008，40(4):546－549.

［26］Kitaguchi A，Yamaguchi N，Nasu M.Enumeration of respiring Pseudomonas spp.in milk within 6 hours by fluorescence in situ hybridization following formazan reduction［J］.Applied and Environmental Microbiology，2005，71(5):2748－2752.

［27］Daims H，Wanger M.Quantification of uncultured microorganisms by fluorescence microscopy and digital image analysis［J］.Appl Mocrobiol Biotechnol，2007，75(2):237－248

［28］Machado A，Almeida C，Carvalho A，et al.Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for identification ofLactobacillusspp.in milk samples［J］.International Journal of Food Microbiology，2013，162(1):64－70.

［29］Yamaguchi N，Kitaguchi A，Nasu M.Selective enumeration of viable Enterobacteriaceae and Pseudomonas spp.in milk within 7 h by multicolor fluorescence in situ hybridization following microcolony formation［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2012，113(6):746－750.

［30］Wang Y，Hammes F，De Roy K，et al.Past，present and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology［J］.Trends in Biotechnology，2010，28(8):416－424.

［31］Cassoli L D，Francischetti G，Machado P F，et al.The relationship of flow cytometry results with classical measures of bacterial counts in raw refrigerated milk［J］.International Journal of Dairy Technology，2010，63(2):297－300.

［32］Flint S，Walker K，Waters B，et al.Description and validation of a rapid(1h)flow cytometry test for enumerating thermophilic bacteria in milk powders［J］.Journal of Applied Microbiology，2007，102(4):909－915.

［33］Yamaguchi N，Ohba H，Nasu M.Simple detection of small amounts of Pseudomonas cells in milk by using a microfluidic device［J］.Letters in Applied Microbiology，2006，43(6):631－636.

［34］Ikeda M，Yamaguchi N，Nasu M.Rapid on－chip flow cytometric detection of Listeria monocytogenes in Milk［J］.Journal of Health Science，2009，55(5):851－856.

［35］尹子波，侯玉柱，尹建军，等.ATP生物发光技术在微生物检测中的应用［J］.食品研究与开发，2012，33(2):228－232.

［36］Sharma G，Malik D J.The uses and abuses of rapid bioluminescence－ based ATP assays［J］.International Journal of Hygiene and Environmental Health，2013，216(2):115－125.

［37］李春艳，霍贵成，王德国，等.ATP生物发光法快速测定生乳中微生物总数的研究［J］.食品工业科技，2008，39(7):233－234.

［38］Wu H Q，Wu Q P，Zhang J M，et al.Study on rapid quantitative detection of total bacterial counts by the ATP－bioluminescence and application in probiotic products ［J］.International Journal of Food Science and Technology，2011，46(5):921－929.

［39］Cheng Y X，Liu Y J，Huang J J，et al.Combining biofunctional magnetic nanoparticles and ATP bioluminescence for rapid detection of Escherichia coli［J］.Talanta，2009，77(4):1332－1336.