申慧芳+申惠敏+贾秀珍等

摘要：用昆虫杆状病毒表达系统表达了高致病性禽流感H5N1 HA蛋白，经SDS-PAGE和Western blot检测，HA蛋白表达分子量约为70 ku；将HA蛋白制成油乳液，免疫BALB/c小鼠，免疫3次后，收集血清，以血凝抑制试验（HI）和血清IgG抗体酶联免疫吸附试验（ELISA）评估体液免疫，酶联免疫斑点试验（ELISPOT）评估细胞免疫。试验结果表明：重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组免疫小鼠后，血清中和抗体效价及ELISA IgG效价均显著高于PBS 组，重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组之间差异不显著。ELISPOT试验数据显示，重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组小鼠脾单个核细胞分泌IFN-γ和IL-4细胞数量显著高于PBS组，而重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组之间差异不显著。用昆虫杆状病毒表达系统表达H5N1 HA蛋白制成油乳液能诱导体液免疫和细胞免疫，能为预防高致病性禽流感H5N1候选疫苗的筛选提供依据。

关键词：H5N1高致病性禽流感；Sf9昆虫细胞；HA蛋白；免疫反应

中图分类号： S855.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0024-04

收稿日期：2014-03-14

基金项目：国家自然科学基金（编号：31360212）；广东省深圳市科技研发资金基础研究计划（编号：JC201105201028A）。

作者简介：申慧芳（1976—），女，山西长治人，博士，副教授，主要从事食品安全生物学研究。E-mail：hethershen@gmail.com。禽流感（avian influenza）是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一种禽类传染病，其中高致病性禽流感（high pathogenic avian influenza，HPAI）H5N1亚型更是养禽业的一大灾难性疾病，不仅给养禽业带来了巨大的经济损失；同时，它正在突破种间屏障，引起人类感染，从病禽直接感染人类病死率高达60%[1]，给公共卫生带来威胁。可通过减少禽对禽的传播以及禽对人类的传播，并进行有效的免疫来保护养禽业的健康发展[2]。预防H5N1高致病性禽流感的传统疫苗是由鸡胚生产的。然而这种方法生产疫苗存在很大的风险，如由于病毒致死鸡胚而影响疫苗生产[3]。另外，高致病性禽流感的疫苗生产和处理需要生物安全三级实验室[4]。因此，寻找一种可以替代传统疫苗而又高效安全的疫苗就成了当务之急。

血凝素蛋白（hemagglutinin，HA）是禽流感病毒最重要的结构蛋白，在病毒吸附、穿膜及决定病毒的宿主特异性和致病力方面均起着关键的作用[5]。HA蛋白也是AIV诱导保护性免疫的主要抗原，它刺激机体所产生的抗体可以中和病毒、抵抗感染[6-7]。因此，HA蛋白成为发展亚单位疫苗的首选[8]。当流感疫情发生时，只要分离到流行毒株，进行HA基因测序就可以进行序列合成并表达蛋白，这种方式周期短、产量高，将在流感疫情高发时代替传统疫苗进行快速有效地控制病症的流行。

本试验选用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统进行重组HA蛋白表达，用表达的HA蛋白和H5N1禽流感全病毒灭活疫苗进行体液免疫和细胞免疫评估，为今后研制快速、高效、安全的H5N1禽流感疫苗提供有效的依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株与质粒E. coli DH5α菌种（笔者所在实验室保存）；E.coli DH10Bac菌种、pFastbacDual质粒、Sf9昆虫细胞、Cellfectin Ⅱ Reagent购自Invitrogen公司；pMD-18 T载体、Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶均购自TaKaRa公司；sf 900 Ⅱ SFM、Graces Insect Cell Culture Medium 购自 GIBCO公司；质粒提取试剂盒购自天根生物工程公司；DNA 胶回收试剂盒、预染蛋白质 Marker 购自Fermentas公司；显影液定影液购自碧云天生物技术研究所；ECL显色液、DAB显色液均购自BBI公司；H5N1高致病性禽流感高免血清购自广东温氏研究院；HRP标记的兔抗鸡IgG购自KPL公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2试验动物6周龄BALB/c小鼠（体质量16～18 g/只）购自中山大学实验动物中心。

1.1.3阳性对照疫苗本研究免疫组用的阳性对照为肇庆大华农生物药品有限公司生产的重组禽流感病毒灭活疫苗 H5N1亚型，Re-5，兽药生字（2006）190022098；证书编号：（2007）兽药GMP 证字178号。

1.2试验方法

1.2.1HA 基因的获得参照GenBank中注册的禽流感病毒A/goose/GD/96（H5N1）毒株（序列号HA：NC_007362.1），将HA基因送去Invitrogen公司进行核苷酸序列合成。根据合成的序列设计用以扩增HA基因的特异性引物，其中上游引物H5N1-HA-F：5′-CGCGGATCCGATGGAGAAAATAGTGC-3′（含BamHⅠ酶切位点）；下游引物H5N1-HA-R：5′-CCGGTCGACTTAAATGCAAATTCTG-3′（含SalⅠ酶切位点）。 PCR扩增体系为50 μL，其中5×PCR buffer 10 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）4 μL，模板1 μL，引物各1 μL，Taq酶 0.5 μL，灭菌双蒸水补至50 μL。纯化的PCR产物经 BamHⅠ 和SalⅠ双酶切，连接至经相同限制性内切酶酶切的质粒pFastbacDual，转化DH5α感受态细胞。酶切鉴定后，筛选出重组质粒 pFastbacDual-HA。将阳性重组质粒 pFastbacDual-HA 转化DH10Bac感受态细胞，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定后，抽提重组杆粒rBacmid-HA，PCR鉴定时使用的通用序列参照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统使用手册。所有引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.2.2重组蛋白HA的表达重组的rBacmid-HA通过CellfectinⅡreagent转染进昆虫细胞Sf9。将Sf9细胞置于含有10% FBS（胎牛血清）的Grace昆虫细胞培养基，28 ℃孵育。当6孔板中每孔细胞浓度为1×106个/mL时，让其吸附 1 h。将 1 μg rBacmid-HA（Bacmid空杆粒作为阴性对照）溶于 100 μL 不完全培养基中（不含血清或双抗的Grace培养基）；将5 μL Cellfectin溶于100 μL不完全培养基；两者混合均匀在室温孵育 15～45 min后加入Sf9细胞，28 ℃孵育 5 h，弃去转染培养基，加入新鲜培养基。当细胞出现明显病变后（第 1 代约需4 d），收集含病毒的培养上清，即为第一代重组病毒，记为P1。P1代病毒种子液量少、效价低，用 P1继续感染Sf9细胞产生效价高的P2种子液。P2代病毒液感染细胞后，收集感染72 h 后的细胞培养上清直接用于后续检测。细胞用PBS（磷酸盐缓冲液）洗3次，经3次反复冻融后超声破碎，然后在4 ℃、12 000 g 条件下离心 10 min，取上清，用12% SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺）胶进行蛋白电泳检测。

1.2.3表达产物的鉴定将 SDS-PAGE电泳中得到的蛋白用半干法转至PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，含3%BSA（牛血清白蛋白）封闭；1 ∶1 000的H5N1禽流感高免血清作为一抗，1 ∶5 000的HRP标记的兔抗鸡IgG作为二抗，用ECL进行显色。

1.2.4间接免疫荧光试验（IFA）通过间接免疫荧光试验观察重组蛋白在Sf9细胞的表达及定位。在6孔板中以 1×106个/mL 的浓度接种Sf9细胞，贴壁2 h后，接种约0.5个MOI（病毒感染复数）的重组杆状病毒上清。感染48 h后，用PBS 清洗细胞3 次；用4%多聚甲醛固定细胞15 min，PBS 洗细胞3 次；用预冷的100%甲醇（4 ℃）处理10 min，PBS清洗3次；3% BSA室温封闭1 h，PBS 清洗3 次；以H5亚型免疫阳性血清为一抗（1 ∶200），37 ℃ 孵育1 h，PBS清洗细胞3 次；用1 ∶1 000倍稀释的FITC（异硫氰酸荧光素）标记的荧光二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBS 清洗细胞3 次；置于荧光显微镜下拍照。

1.2.5油乳液疫苗的制备将定量后的细胞破碎液与油乳剂按2 ∶1体积混合，高速匀浆，获得的油乳剂疫苗4 ℃保存备用。

1.2.6动物分组与免疫试验选取体质量16～18 g的6周龄BALB/c 雌性小鼠随机分成3组，分别为重组HA蛋白组、H5N1禽流感灭活疫苗组和PBS组（阴性对照），每组10只。采用颈部皮下多点注射，从6周龄开始进行免疫，此后每间隔14 d加强免疫1次，共免疫3次，每次免疫剂量为10 μg/只，以HA蛋白含量为标准。3次免疫后，每组随机取5只试验小鼠，眼球取血，室温下分离血清，用HI和ELISA方法检测H5N1抗体水平。每个试验组随机取3只小鼠，取脾脏，用淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞，进行酶联免疫斑点试验（ELISPOT），检测分泌IFN-γ与IL-4细胞因子的细胞数量。

1.2.7血凝抑制试验（HI试验）参照《国家流感中心标准操作规程》中的“流感/禽流感病毒血凝抑制试验（HI）操作细则”进行操作。

1.2.8间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IgG抗体采用棋盘法确定最佳的抗原包被浓度、血清稀释度。用 100 μL/孔包被96孔板，用1%BSA封闭，加入用0.1% BSA稀释的待检血清于上述已包被的反应孔中，充分洗涤后，加入 1 ∶10 000 的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，在酶标仪上读取450 nm下的吸光度（D450 nm）。

1.2.9酶联免疫吸附斑点试验按达科为生物公司“酶联免疫吸附斑点试验操作细则”进行操作，将ELISPOT板斑点计数，并将重组HA蛋白组、全病毒灭活疫苗组及PBS组分别作数据间的t检验，进行统计学分析。

2结果与分析

2.1HA基因的克隆

以合成的A/duck/Guangdong/22/2002（H5N1）禽流感HA基因为模板，进行PCR扩增，将HA的PCR产物和 pFastBacDual 经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后，回收并连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，经琼脂糖凝胶电泳检测及测序，获得扩增产物大小为1 707 bp，与预计扩增片段长度相符合（图1），表明已筛选出重组质粒pFastBacDual-HA。

2.2重组杆粒构建

将重组质粒pFastBacDual-HA转化到DH10Bac中，通过庆大霉素、卡那霉素、四环素3种抗性和Blue-Gal蓝白斑筛选得到阳性单菌落克隆，提取杆粒rBacmid-HA，用特异性引物M13通过PCR鉴定重组杆状病毒，与预期结果一致（图2）。

2.3Western blot鉴定重组HA蛋白的表达

将rBacmid-HA病毒种子液以1倍感染复数（MOI=1）接种Sf9昆虫细胞，收集72 h后的细胞培养上清，超声破碎，进行Western blot分析，一抗为H5N1亚型禽流感高免血清，二抗为HRP标记的兔抗鸡IgG，以野生杆状病毒表达蛋白作为对照。如图3所示，出现分子量约70 ku的单一多肽，证明重组杆状病毒表达了HA蛋白。在昆虫细胞中，重组HA蛋白没有裂解为HA1和HA2亚基。

2.4间接免疫荧光结果

重组杆状病毒感染Sf9细胞48 h后进行IFA，从而鉴定及定位重组HA蛋白的表达，结果显示，重组蛋白高效表达于细胞表面（图4）。

2.5体液免疫

2.5.1免疫BALB/c小鼠血清中HI效价用重组的HA蛋白油乳液、全病毒灭活疫苗和PBS免疫BALB/c小鼠，检测3免后小鼠血清中HI效价。结果显示，免疫重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组显著高于PBS对照组，而重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组差异不显著（图5-A）。

2.5.2免疫BALB/c小鼠血清中IgG抗体水平检测用间接ELISA检测BALB/c小鼠血清中IgG抗体，结果显示，重组HA蛋白组与全病毒灭活疫苗组IgG抗体均有升高，两者显著高于PBS组（P<0.05），重组HA蛋白组与全病毒灭活疫苗组差异不显著（图5-B）。

2.6免疫小鼠脾淋巴细胞中分泌细胞因子IFN-γ和IL-4检测

用大肠杆菌BL21表达的HA蛋白作抗原，刺激3次免疫后小鼠脾淋巴细胞，通过ELISPOT技术对产生的细胞因子IFN-γ和IL-4进行检测。结果显示，重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组脾淋巴细胞经刺激后分泌细胞因子IFN-γ和IL-4的细胞数量均显著高于PBS组（P<0.05），但重组HA蛋白组和全病毒灭活疫苗组之间差异不显著（图6）。

3结论与讨论

H5N1型高致病性禽流感病毒在世界范围内分布广、危害性大，不仅造成了养禽业的巨大损失，也影响到人类健康和安全。目前，尚无特效药物用于临床治疗，接种疫苗是预防和控制该病发生的主要手段和途径。传统疫苗用鸡胚生产，生产周期长、生物安全性要求高，无法应对流感病毒的大范围流行。本研究用昆虫杆状病毒表达系统生产的重组HA蛋白，表达效率高、周期短、生物安全性好。 HI试验结果显示：重组HA蛋白与全病毒灭活苗免疫产生的效价相一致，HI效价的高低与攻毒免疫保护有直接的相关[9-15]，HI效价越高对禽流感病毒感染的保护效果越好，保护的时间越长；ELISA结果表明：重组HA蛋白的IgG抗体与全病毒灭活疫苗之间无显著差别；ELISPOT试验结果表明：重组HA蛋白组可诱导产生强烈的细胞免疫应答，有利于机体对感染病毒和细胞的直接杀伤，从而快速清除机体内的病毒。

本试验从通过获得H5N1 HA基因序列到转染昆虫细胞，进行HA蛋白高效表达（分子量约70 ku），以及感染细胞裂解，制备油乳液，全部过程只用了约30 d；通过BALB/c小鼠免疫，刺激机体产生较强的体液免疫和细胞免疫反应，为禽流感基因工程亚单位疫苗的研发奠定了基础。

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