卿 晶，陈宝军，罗联哲，阳国桂，洪 业，韩振义,3，胡 骥,*

1.中国原子能科学研究院 同位素研究所，北京 102413；2.原子高科股份有限公司，北京 102413；3.门头沟区食品药品监督管理局，北京 102300

99Tcm(CO)3-BPHRGD的制备及正常鼠体内生物分布

卿 晶1,2，陈宝军1，罗联哲2，阳国桂2，洪 业1,2，
韩振义2,3，胡 骥1,2,*

1.中国原子能科学研究院 同位素研究所，北京 102413；2.原子高科股份有限公司，北京 102413；
3.门头沟区食品药品监督管理局，北京 102300

制备了99Tcm(CO)3-BPHRGD，并进行体内外生物学评价。在pH=7、75 ℃条件下反应30 min，99Tcm(CO)3-BPHRGD的标记率均大于80%，纯化后标记物的放射化学纯度大于98%；体外稳定性实验显示，在37 ℃时，标记物在生理盐水、胎牛血清及半胱氨酸溶液中具有很好的稳定性；正常小鼠体内生物分布数据显示，99Tcm(CO)3-BPHRGD在血液中清除较快，主要通过肝肾代谢。

RGD；99Tcm；整合素αvβ3；生物分布

血管生成(angiogenesis)是恶性肿瘤生长和转移所必需的[1-2]。没有足够的血管，肿瘤就会坏死或凋亡[3]。研究发现，整合素αvβ3在肿瘤新生血管内皮细胞及多种肿瘤细胞表面有高度表达，而在成熟血管内皮细胞中表达很少[3-5]，这使得整合素αvβ3已成为肿瘤诊断与治疗的一个重要靶点。RGD肽是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的一类短肽，能与整合素αvβ3受体特异性结合[6]，因此，放射性核素标记的含RGD肽的放射性药物备受关注，并应用于肿瘤的诊断与治疗[7-12]。目前以RGD为核心的基础上衍生出多种形式，如环状RGD、多价RGD、糖基化或PEG修饰RGD、螯合剂偶联的RGD、纳米载体的RGD等。

利用90Y、111In、177Lu、99Tcm等核素标记多肽时，需要引入适当的双功能螯合剂，不同的双功能螯合剂会引起标记物体内性质的改变[13]。99Tcm有着优良的物理性质，在放射性药物在临床核医学诊断中占主导地位，其用量约占临床诊断用放射性药物的85%以上。

鉴于99Tcm标记药物在临床应用中的优势，国内外多用99Tcm-HYNIC标记RGD及其衍生物应用于肿瘤的诊断[14-15]。本研究通过对目前研究较多的c(RGDyK)(图1)进行结构修饰，设计并合成6-(二(吡啶-2-甲基)氨基)己酸-RGD(BPHRGD)(图1)，用[99Tcm(CO)3(H2O)3]+标记，拟得到99Tcm(CO)3-BPHRGD，并进行正常鼠体内外生物学评价。另外，BPHRGD中的3N结构同时也可以与Cu配位[16]，因此可制备64Cu-BPHRGD用于PET显像研究。

1 实验材料

1.1实验动物

雌性昆明小白鼠，一级，约25 g，由中国医学科学院肿瘤研究所提供。

1.2试剂及仪器

2,3,5,6-四氟苯酚、N,N′-二环己基羰二亚胺(EDC)、2-氯甲基吡啶盐酸盐，均由美国阿尔法公司提供；半胱氨酸盐酸盐，上海康达氨基酸厂；NaBH4，分析纯，美国百灵威公司；c(RGDyK)，纯度99.25%，吉尔生化(上海)有限公司；CO，纯度99.99%，北京市亚南气体有限公司；Na99TcmO4淋洗液，原子高科股份有限公司；甲醇、乙腈，色谱纯，美国Burdick&Jackson公司；其他化学试剂，分析纯，北京化学试剂公司。

RE-52型旋转蒸发仪，上海博通公司；高纯水器，美国Millipore公司；1470自动伽玛计数器，芬兰Perkin Elmer公司；C-18 Sep-Pak色谱柱，美国Waters公司；CRC-15R放射性活度计，美国Capintec公司。ProStar 320型HPLC，美国Varian公司；C18色谱柱，Hypersil ODSφ4.6 mm×250 mm；GABI型高效液相色谱放射性监控仪，德国Raytest公司。

图1 c(RGDyK)与BPHRGD的结构Fig.1 Structure of c(RGDyK) and BPHRGD

2 实验方法

2.1质量控制方法

HPLC法：溶剂A为0.1%三氟乙酸(TFA)/H2O，溶剂B为0.1%TFA/乙腈，流速1 mL/min，紫外检测器波长220 nm。梯度洗脱程序为：0—1 min，0%溶剂B；1—15 min，0%～90%溶剂B；15—16 min，90%溶剂B；16—18 min，90%～0%溶剂B；18—20 min，0%溶剂B。

2.2BPHRGD的合成

BPHRGD的合成路线示于图2。

2.2.16-(二(吡啶-2-甲基)氨基)己酸(6-(bis(pyridin-2-ylmethyl)amino)hexanoic acid)的合成[16]取2.624 0 g(0.02 mol)6-氨基己酸溶于30 mL水中，再加入6.889 7 g(0.042 mol)2-氯甲基吡啶盐酸盐和3.2 g(0.08 mol)NaOH，常温搅拌1 d。反应结束后，首先在碱性条件下用20 mL氯仿萃取3次，再用1 mol/L HCl调节水层的pH值为3，再用20 mL氯仿萃取3次，收集酸性萃取层，旋蒸除去溶剂后，得红色的油状物，经柱色谱纯化后得黄色油状物，真空干燥。

2.2.26-(二(吡啶-2-甲基)氨基)己酸-(2,3,5,6-四氟)苯酯(2,3,5,6-tetrafluorophenyl 6-(bis(pyridin-2-ylmethyl)amino)hexanoate)的合成[17]取0.130 8 g(0.417 5 mmol)6-(二(吡啶-2-甲基)氨基)己酸溶于4 mL二氯甲烷，再加入0.160 1 g(0.835 mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)，常温下震荡30 min后，加入0.104 0 g(0.626 3 mmol)2,3,5,6-四氟苯酚，常温下震荡6 h。反应结束后，旋蒸除去溶剂后，用乙酸乙酯溶解产物，再用饱和Na2CO3洗乙酸乙酯4次，经柱色谱纯化后得黄色油状物，真空干燥。

2.2.3BPHRGD合成 取5 mg RGD溶于1 mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)和30 μL(0.24 mmol)三乙胺中，然后加入10 mg(0.021 7 mmol)6-(二(吡啶-2-甲基)氨基)己酸-(2,3,5,6-四氟)苯酯，室温振荡2 h，用油泵抽去溶剂，残留物溶于0.5 mL水中，通过HPLC分离纯化，浓缩后，冻干，冷藏待用。

图2 BPHRGD的合成路线Fig.2 Synthesis of BPHRGD

2.3[99Tcm(CO)3(H2O)3]+中间体的制备

在10 mL青霉素瓶中先加入4 mg Na2CO3，5.5 mg NaBH4，15 mg酒石酸钾钠，然后加入0.5 mL去离子水溶解，密封后通入CO气体15 min，将瓶中空气排净。然后用注射器加入1 mL Na99TcmO4洗脱液(1.85×108～1.85×109Bq)，在75 ℃条件下加热反应30 min(图3)，冷却至室温后，用1 mol/L HCl调pH=7，用HPLC法分析其放化纯。

2.499Tcm(CO)3-BPHRGD的制备

取3 mL青霉素真空瓶，然后加入30 μL BPHRGD肽的溶液(1 g/L，pH=7)和0.1 mL新鲜制备的羰基锝溶液[99Tcm(CO)3(H2O)3]+，75 ℃下反应30 min(图3)，待反应溶液冷却到室温后，用HPLC法分析标记物的标记率，再用C18 Sep-Pak反向萃取柱对标记物进行了纯化，用HPLC法分析标记物放化纯。

2.599Tcm(CO)3-BPHRGD的脂水分配系数测定

取20 μL纯化后的99Tcm(CO)3-BPHRGD，加入到含500 μL正辛醇和480 μL磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.4，0.05 mol/L)的EP管中，涡旋混匀30 min后在2 000 r/min条件下离心15 min，分别取100 μL有机相和水相测量放射性计数，计算标记物的脂水分配系数P(有机相计数/水相计数)及lgP。

2.699Tcm(CO)3-BPHRGD的体外稳定性

将标记物分别稀释于生理盐水、10%胎牛血清、0.01 mol/L半胱氨酸溶液中，于37 ℃下放置24 h，分别于1、2、4、6、24 h取样，用HPLC法检测标记物的放射化学纯度。

2.7正常鼠体内生物学分布

取雌性昆明小白鼠16只，随机分组，每组4只。经尾静脉注射0.1 mL标记物(约1.5 MBq，含BPHRGD肽小于1 μg)，于注射后10、30、60、240 min断颈处死小鼠，取血、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、肾上腺等主要脏器，称重并测量其放射性计数，经衰变校正后，计算每克组织百分注射剂量率(ID%/g)，获得标记物在正常小鼠体内生物学分布数据。

3 结果与讨论

3.16-(二(吡啶-2-甲基)氨基)己酸(6-(bis(pyridin-2-ylmethyl)amino)hexanoicacid)的合成表征

随着反应的进行，反应液由无色变为红褐色，TLC展开剂为氯仿/甲醇(体积比为9∶1)，Rf=0.3。此反应的副产物较多，纯化困难，经柱色谱纯化后得黄色油状物1.13 g，产率为18%。

1H-NMR(400 MHz，CDCl3，δ)： 8.55～8.53(d，2H，HPy-6，J=4.9 Hz)；7.68～7.64(t，2H，HPy-4，J=7.6 Hz)；7.56～7.54(d，2H，HPy-3，J=7.8 Hz)；7.19～7.15(t，2H，HPy-5，J=6.1 Hz)；3.88(s，4H，HPy-α)；2.62～2.58(t，2H，1-CH2，J=7.3 Hz)；2.33～2.28(t，2H，5-CH2，J=7.4 Hz)；1.64～1.56(m，4H，2-CH2+ 4-CH2)；1.35～1.29(m，2H，3-CH2)。MS (ESI)：m/z[C18H24N3O2]+(M+H)+，314.18；实测值，314.2。

3.26-(二(吡啶-2-甲基)氨基)己酸-(2,3,5,6-四氟)苯酯(2,3,5,6-tetrafluorophenyl6-(bis(pyr-idin-2-ylmethyl)amino)hexanoate)的合成表征

反应通过紫外显色监测反应进程，TLC展开剂为氯仿/甲醇(体积比9∶1)，Rf=0.5。经柱色谱纯化后得黄色油状物，干燥称重得0.077 g，产率为40%。

1H-NMR(400 MHz，CDCl3，δ)：8.52～8.80(d，2H，HPy-6，J=4.9 Hz)；7.67～7.62(t，2H，HPy-4，J=7.6 Hz)；7.55～7.53(d，2H，HPy-3，J=7.7 Hz)；7.16～7.12(t，2H，HPy-5，J=6.1 Hz)；7.02～6.93(m，1H，ArF4H)；3.84(s，4H，HPy-α)；2.62～2.58(t，2H，1-CH2，J=7.3 Hz)；2.61～2.56(t，2H，5-CH2，J=7.5 Hz)；1.73～1.65(m，2H，4-CH2)；1.64～1.56(m，2H，2-CH2)；1.43～1.35(m，2H，3-CH2)。MS(FAB)：m/z[C24H24F4N3O2]+(M+H)+，462.18；实测值，462.1。

图3 99Tcm(CO)3-BPHRGD制备路线图Fig.3 Preparation of 99Tcm(CO)3-BPHRGD

3.3BPHRGD的合成表征

为使RGD反应完全，6-(二(吡啶-2-甲基)氨基)己酸-(2,3,5,6-四氟)苯酯应适当过量。此偶联反应迅速，在室温下振荡1.5 h即可反应完全。由于DMF在HPLC中有较强的吸收峰，在用HPLC纯化产物时有很大的干扰，因此应先除去DMF溶剂后再进行纯化。纯化后经冻干得纯度大于99%的白色粉末3.77 mg，产率约为51%。MS(ESI)：m/z[C45H63N12O9]+(M+H)+，915.48；实测值，915.1。

3.4[99Tcm(CO)3(H2O)3]+和99Tcm(CO)3-BPHRGD的制备

[99Tcm(CO)3(H2O)3]+的制备方法已经很成熟，在通入足量CO和保证NaBH4不发生潮解的情况下可以高产率地制得。放化纯(RCP)可以达到99%以上。制备完成后将pH值调为中性，常温下，[99Tcm(CO)3(H2O)3]+可稳定放置24 h以上。优化标记条件后，99Tcm(CO)3-BPHRGD的标记率可稳定在80%以上，经C-18 Sep-Pak柱纯化后，标记物放射化学纯度大于98%(图4)，纯化后，99Tcm(CO)3-BPHRGD的比活度为3.29×1015Bq/kg(比活度=A·Y/m，其中A为总活度，Y为标记率，m为BPHRGD的投料质量)。

图4 纯化后的99Tcm(CO)3-BPHRGDFig.4 99Tcm(CO)3-BPHRGD purified

3.599Tcm(CO)3-BPHRGD的脂水分配系数

99Tcm(CO)3-BPHRGD的脂水分配系数P=0.227，lgP=-0.644，脂溶性较好，这可能是由于BPHRGD增长了RGD碳链的缘故，这与它们在肝中有较高的摄取值一致。

3.699Tcm(CO)3-BPHRGD的体外稳定性结果

37 ℃下，99Tcm(CO)3-BPHRGD在生理盐水和胎牛血清中具有很高的稳定性(图5)。放置24 h，其稳定性无显著变化，其放化纯始终高于95%。99Tcm(CO)3-BPHRGD的放化纯在半胱氨酸溶液中略有下降，但始终高于90%，表明99Tcm(CO)3-BPHRGD基本不与巯基发生配体交换反应。由于生物体内含有一些游离的巯基化合物，与99Tcm标记物在体内竞争络合，体外竞争稳定性实验结果可以间接反映99Tcm标记物在生物体内的稳定性，由此可推断99Tcm(CO)3-BPHRGD在生物体内比较稳定。

■——生理盐水(Saline)，▲——胎牛血清(Serum)，▼——半胱氨酸(Cysteine)

3.7正常鼠体内生物分布

表1列出了99Tcm(CO)3-BPHRGD在正常小鼠体内的生物分布数据。由表1可知，99Tcm(CO)3-BPHRGD注入体内10、30、60、240 min后，标记物在血液中的清除较快；肝中的摄取值最高，与标记物具有较高的脂水分配系数一致(lgP=-0.644)，说明标记物主要通过肝脏代谢；肾作为药物的代谢产物的主要排泄器官，也有较高的摄取；因此可以判断标记物通过肝脏代谢、肾脏排泄。

4 结 论

本研究工作合成的RGD衍生物BPHRGD能很好地进行[99Tcm(CO)3(H2O)3]+标记，在体外具有很好的稳定性。在一系列标记条件优化实验基础上，99Tcm(CO)3-BPHRGD的标记率达到80%，纯化后标记物的放射化学纯度大于98%，标记物在正常鼠体内分布研究显示，99Tcm(CO)3-BPHRGD在血液中清除较快，主要通过肝肾代谢。在下一步的研究工作中，将通过荷瘤裸鼠实验进一步对99Tcm(CO)3-BPHRGD进行评价，以期研制出适于肿瘤显像诊断的多肽放射性药物。

表1 99Tcm(CO)3-BPHRGD在正常小鼠体内分布Table 1 Biodistribution of 99Tcm(CO)3-BPHRGD in normal mice

[1]Carmeliet P. Angiogenesis in health and disease[J]. Nat Med, 2003, 9(6): 653-660.

[2]Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications[J]. N Engl J Med, 1971, 285(21): 1182-1186.

[3]Brooks P C, Clark R A, Cheresh D A. Requirement of vascular integrin alpha v beta 3 for angiogenesis[J]. Science, 1994, 264(5158): 569-571.

[4]Ruoslahti E. Specialization of tumour vasculature[J]. Nat Rev Cancer, 2002, 2(2): 83-90.

[5]Zitzmann S, Ehemann V, Schwab M. Arginine-glycine-aspartic acid (RGD)-peptide binds to both tumor and tumor-endothelial cellsinvivo[J]. Cancer Res, 2002, 62(18): 5139-5143.

[6]Pasqualini R, Koivunen E, Ruoslahti E. Alpha v integrins as receptors for tumor targeting by circulating ligands[J]. Nat Biotechnol, 1997, 15(6): 542-546.

[7]Bianchini F, Cini N, Trabocchi A, et al. (125)I-radiolabeled morpholine-containing arginine-glycine-aspartate(RGD) ligand of alpha(v)beta(3)integrin as amolecular imaging probe for angiogenesis[J]. J Med Chem, 2012, 55(11): 5024-5033.

[8]张春丽，王荣福，张丽，等.靶向整合素αvβ3受体的新型RGD肽二聚体的131I标记与生物活性的初步评价[J].北京大学学报(医学版)，2011，43(2)：295-300.

[9]Liu Z, Huang J, Dong C, et al.99mTc-labeled RGD-BBN peptide for small-animal SPECT/CT of lung carcinoma[J]. Mol Pharm, 2012, 9(5): 1409-1417.

[10]Liu Z, Shi J, Jia B, et al. Two90Y-labeled multimeric RGD peptides RGD4 and 3PRGD2 for integrin targeted radionuclide therapy[J]. Mol Pharm, 2011, 8(2): 591-599.

[11]Liu Z, Niu G, Wang F, et al. (68)Ga-labeled NOTA-RGD-BBN peptide for dual integrin and GRPR-targeted tumor imaging[J]. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2009, 36(9): 1483-1494.

[12]Briat A, Wenk C H, Ahmadi M, et al. Reduction of renal uptake of111In-DOTA-labeled and A700-labeled RAFT-RGD during integrin alpha v beta 3 targeting using single photon emission computed tomography and optical imaging[J]. Cancer Sci, 2012, 103(6): 1105-1110.

[13]Liu S, Edwards D S. Bifunctional chelators for therapeutic lanthanide radiopharmaceuticals[J]. Bioconjug Chem, 2001, 12(1): 7-34.

[14]Zhou Y, Kim Y S, Chakraborty S, et al.99mTc-labeled cyclic RGD peptides for noninvasive monitoring of tumor integrin alpha v beta 3 expression[J]. Mol Imaging, 2011, 10(5): 386-397.

[15]Bohn P, Modzelewski R, Rouvet J, et al. Biodistribution and imaging of [99mTc]-HYNIC-RGD in MDA-MB-231 and NTERA-2 cancer cell xenografts[J]. Nucl Med Commun, 2013, 34(7): 709-717.

[16]Kirin S I, Dubon P, Weyhermuller T, et al. Amino acid and peptide bioconjugates of copper(Ⅱ) and zinc(Ⅱ) complexes with a modified N,N-bis(2-picolyl) amine ligand[J]. Inorg Chem, 2005, 44(15): 5405-5415.

[17]Kim I S, Yoo T M, Kobayashi H, et al. Chemical modification to reduce renal uptake of disulfide-bonded variable region fragment of anti-Tac monoclonal antibody labeled with99mTc[J]. Bioconjug Chem, 1999, 10(3): 447-453.

Preparationof99Tcm(CO)3-BPHRGDandBiodistributionEvaluationinNormalMice

QING Jing1, 2, CHEN Bao-jun1, LUO Lian-zhe2, YANG Guo-gui2, HONG Ye1, 2, HAN Zhen-yi2, 3, HU Ji1, 2, *

1.China Institute of Atomic Energy, P. O. Box 275(104), Beijing 102413, China;
2.Atom Hi-Tech Co., Ltd., Beijing 102413, China; 3.Mentougou Food and Drug Administration, Beijing 102300, China

99Tcm(CO)3-BPHRGD was prepared, and theinvitroandinvivobiological evaluations were completed. The labeling yield of99Tcm(CO)3-BPHRGD is more than 80% under optimal conditions(pH=7, reacting at 75 ℃ for 30 min), and the radiochemical purity is more than 98% after purified. Stabilityinvitroexperiments show that the radiolabeled compound shows good stability in physiological saline, fetal bovine serum, and cysteine solution under 37 ℃. The biodistribution of99Tcm(CO)3-BPHRGD in normal mice shows that the metabolic pathways are mainly though liver and kidney with rapid clearance in blood.

RGD;99Tcm; integrin αvβ3; biodistribution

2013-12-20；

2014-02-20

卿 晶(1985—)，男，四川内江人，博士研究生，放射性同位素技术专业

*通信联系人：胡 骥(1966—)，男，安徽休宁人，博士生导师，研究员，放射性药物化学专业，E-mail: ji_hu@ciae.ac.cn

O615.4

A

0253-9950(2014)02-0086-06

10.7538/hhx.2014.36.02.0086