贾丽娜，江大卫，程登峰，张 岚

1.中国科学院 上海应用物理研究所 放射化学与工程技术部，上海 201800；2.中国科学院大学，北京 100049；3.复旦大学 附属中山医院，上海 200032

一种靶向TGR5的胆汁酸类化合物的18F标记与初步评价

贾丽娜1,2，江大卫1,2，程登峰3，张 岚1,*

1.中国科学院 上海应用物理研究所 放射化学与工程技术部，上海 201800；
2.中国科学院大学，北京 100049；3.复旦大学 附属中山医院，上海 200032

G-蛋白偶联受体(TGR5)是一类位于细胞膜上的胆汁酸受体，与体内的糖代谢、能量代谢和胰高血糖素样多肽-1的分泌密切相关。相对于正常组织，TGR5在多种肿瘤组织中过量表达，并与患者的预后相关，是肿瘤诊断、治疗和预后评估的一个潜在靶点。因此，利用点击化学的方法简单高效的制备了一种靶向TGR5的18F-PET探针[18F]FEA-LCA。该探针具有较高的放射化学产率(66%～74%)、比活度(大于300 PBq/mol)和放射化学纯度(大于99%)。[18F]FEA-LCA具有其母体化合物LCA相似的亲脂性，并具有良好的体外稳定性。本工作为进一步研究[18F]FEA-LCA作为TGR5过量表达的肿瘤的PET探针奠定了良好的基础。

胆汁酸；TGR5；18F；石胆酸；PET显像

胆汁酸是胆汁的主要成分，是在肝细胞内由胆固醇转化而来的，能够促进脂肪和脂溶性维生素的乳化和吸收[1]。胆汁酸更是一类重要的信号分子，既能激活各种核受体(如：法尼酯X受体)，又能激活细胞膜受体G-蛋白偶联受体(TGR5)[2]。TGR5又称BG37或M-BAR，它与体内的糖代谢、能量代谢和胰高血糖素样多肽-1的分泌密切相关[3-4]。人体中，TGR5在单核细胞、巨噬细胞、肠等高表达，在肺、脾、肾、子宫等中度表达，其他组织中弱表达或不表达[5-6]。TGR5通过多条信号通路调节细胞内的生理活性，它可以通过激活JNK通路调节胆汁酸诱导的肝细胞凋亡[7]。TGR5在单核细胞和巨噬细胞中高表达，可通过提升cAMP浓度阻断促炎因子的分泌，从而起到抗炎效果[8]。在人胃癌细胞系AGS中，可由TGR5通过HB-EGF机制发生对EGFR的反式激活[9]。研究发现，TGR5在正常胃上皮细胞弱表达，而在胃癌细胞和胃癌肠转移细胞中高表达，TGR5的表达情况与胃腺癌病人的生存率负相关[10]。在胆管细胞癌[11]、食管癌[12]和结直肠癌[13]中的研究也发现，TGR5相对于正常细胞会过量表达。因此，TGR5是一个非常有潜力的核医学肿瘤诊断和预后评估靶点。

胆汁酸是TGR5的天然内源性配体，多种胆汁酸可以激活TGR5，激活能力的顺序为(非结合型胆汁酸)：石胆酸(LCA)>脱氧胆酸(DCA)>鹅去氧胆酸(CDCA)>胆酸(CA)。其中，LCA是最有效的非结合型胆汁酸，半最大效应浓度(EC50)为530 nmol/L[14]，是TGR5生理水平的胆汁酸类配体。研究发现，在胆汁酸甾核的C-3和C-24位进行结构修饰后，胆汁酸依然保持了对其受体的识别能力[15]。目前，对于TGR5为靶点的显像剂的报道很少见并极具潜力，因此，本工作拟通过点击化学的方法对LCA进行18F标记，并对其体外稳定性进行评价，以期获得一种能够对胃癌、胆管癌和结直肠癌等肿瘤靶向性诊断和预后评估的新型PET显像探针。

1 实验部分

1.1试剂与仪器

石胆酸(LCA)、炔丙基胺和1-羟基苯并三唑(HOBt)，纯度均大于98%，上海泰坦化学有限公司；N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)(纯度大于98%)、L-抗坏血酸钠(sodium L-ascorbate，纯度大于99%)、超干乙腈(AcroSeal)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)(纯度大于99%)，比利时Acros公司；叠氮化钠(NaN3)(纯度大于95%)，上海景颜化工科技有限公司；4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮双环[8.8.8]二十六烷(K222)，法国ABX公司；1-辛醇，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；[18F]F-，上海原子科兴药业有限公司；三乙胺(TEA)、二氯甲烷(CH2Cl2)、五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等，国药集团上海化学试剂有限公司。

400 MHz超导核磁共振波谱仪，瑞士Bruker公司；85-2型恒温磁力搅拌器，上海闵行江浦仪器厂；RE-52-2旋转蒸发仪，上海沪西分析仪器厂；TOF-ESI-MS质谱仪，日本岛津公司；1100高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；SUV-1箱式紫外分析仪，上海科学器材公司。

HPLC分离分析条件：流动相：A水相(含0.1%(体积分数，下同)三氟乙酸)；B乙腈(含0.1%三氟乙酸)，紫外检测波长为205 nm，半制备柱：Agilent XDB C18，9.4 mm×300 mm，5 μm，流速：4 mL/min。分析梯度：0→20→21→24→25 min，30%→65%→95%→95%→30% B。

1.2标记前体(3)的合成

标记前体(3)的合成路线示于图1。搅拌下，于石胆酸(1)377 mg(1 mmol)的30 mL CH2Cl2溶液中依次加入EDC·HCl 230 mg(1.2 mmol)、HOBt 162 mg(1.2 mmol)、三乙胺280 μL(2 mmol)，搅拌10 min后加入炔丙基胺(2)82.5 μL(1.2 mmol)。上述反应液在室温搅拌反应2 d。反应液依次用10 mL水、10 mL饱和碳酸氢钠溶液、10 mL稀盐酸各洗1次，再用饱和氯化钠溶液洗2次(每次10 mL)，有机层无水硫酸钠干燥后，柱层析纯化(固定相:层析硅胶75～48 μm；展开剂：石油醚，乙酸乙酯)得白色固体307.5 mg，收率为74.3%，纯度大于99%(HPLC)。

1.3参比化合物[19F]FEA-LCA的合成

参比化合物[19F]FEA-LCA的合成示于图2。

图1 标记前体的合成路线Fig.1 Synthesis of the labeling precursor

图2 参比化合物[19F]FEA-LCA的合成路线Fig.2 Synthesis of the reference compound [19F]FEA-LCA

1.3.1对甲苯磺酸氟乙酯(5) 冰浴下，将对甲苯磺酰氯(7.15 g，37.5 mmol)溶于80 mL CH2Cl2中，然后依次加入三乙胺(17.4 mL，125 mmol)和DMAP(0.2 g，1.64 mmol)。充分溶解后缓慢向上述溶液中滴加2-氟乙醇(4)的CH2Cl2(20 mL)溶液，滴加完毕后反应体系在室温下搅拌反应2 d。反应液过滤，有机相浓缩后柱层析分离(固定相：层析硅胶75～48 μm；流动相：乙酸乙酯、石油醚梯度洗脱)后得到无色油状物5.4 g。收率为65.3%。

1.3.22-氟叠氮乙烷([19F]FEA) 向化合物对甲苯磺酸氟乙酯(5)(4.26 g，19.54 mmol)的30 mL无水DMF溶液中，加入叠氮化钠(3.81 g，58.63 mmol)，反应混合物在室温下搅拌反应，TLC监测(V(石油醚)∶V(EtOAC)=1∶5)无对甲苯磺酸氟乙酯时，过滤除去固体后得到[19F]FEA的DMF溶液，产物未进一步纯化，直接用于后面的反应。

于是我们得到：抛物线y=ax2+bx+c上有一点C(m，n)，直线l与抛物线交于A，B两点，当∠ACB=90°时，直线l经过一定点

1.3.3参比化合物([19F]FEA-LCA)的点击合成 磁力搅拌下，向1.5 mL pH=6.0磷酸盐缓冲液中先后加入130 μL硫酸铜溶液(0.45 mol/L)和80 μL抗坏血酸钠溶液(1.5 mol/L)，混匀后加入化合物3(20 μmol，8.3 mg)的DMF溶液(1 mL)，10 min后加入[19F]FEA的DMF溶液(100 μmol，155 μL)，50 ℃搅拌反应3 h。冷却至室温，反应液加20 mL水稀释，产物用氯仿萃取3次(每次15 mL)。合并有机层，用饱和氯化钠溶液15 mL洗有机层，减压浓缩后得到产物为白色固体，无需纯化。m=8.6 mg，收率为85.3%，纯度大于99%(HPLC)。

1.4[18F]FEA-LCA的点击化学合成

[18F]FEA-LCA的合成路线示于图3。

1.4.12-[18F]氟叠氮乙烷([18F]FEA) [18F]FEA的合成根据文献[16]的步骤，有少量修改。氮气保护下，向含有活化后的[18F]F-(370～950 MBq)反应瓶中迅速加入对甲苯磺酸叠氮乙酯(6)(5 mg)的无水乙腈溶液400 μL，95 ℃下密闭反应5～10 min，HPLC检测标记率。将该反应液在85 ℃用氮气流辅助蒸馏10 min，冰水浴冷却下收集蒸馏液。得到[18F]FEA的乙腈溶液约400 μL。

图3 [18F]FEA-LCA的合成路线Fig.3 Synthesis of [18F]FEA-LCA

1.4.2[18F]FEA-LCA的点击化学合成 向200 μL pH=6.0磷酸盐缓冲液中依次加入60 μL硫酸铜溶液(0.45 mol/L)和60 μL抗坏血酸钠溶液(1.5 mol/L)，混匀后加入标记前体3(4.0 mg，9.7 μmol)的DMF溶液(400 μL)，涡旋混合1 min后，加入蒸馏冷凝得到的2-[18F]氟叠氮乙烷([18F]FEA)的乙腈溶液(100～185 MBq)，振荡器50 ℃反应15 min。标记产物用HPLC检测并分离。收集产物峰(tR=23.5 min)，减压浓缩除掉溶剂，用含8%乙醇的PBS(pH=7.4)溶解，无菌滤膜过滤后得到[18F]FEA-LCA的制剂。

1.5脂水分配系数

取10 μL[18F]FEA-LCA的制剂于2 mL离心管中(含有600 μL正辛醇和590 μL PBS)，密封好，在室温下充分涡旋2 min后，高速离心3 min(10 000 r/min)，至两相平衡。用移液器从有机相和水相各取样100 μL分置于两只γ计数管中，用γ计数器测定计数。重复取样测定三次。平行进行两批次实验，根据下面公式计算得到平均lgD7.4值。

lgD7.4=lg(N1/N2)

其中：N1，每毫升辛醇的放射性计数率，min-1·mL-1；N2，每毫升缓冲溶液PBS的放射性计数率，min-1·mL-1。

1.6体外稳定性

取[18F]FEA-LCA的制剂(约3.7 MBq，50 μL)分别置于新生牛血清(1 mL)和PBS(1 mL)中，置于37 ℃下，振荡孵育30、60、180 min后，用HPLC测定其放射化学纯度，以观察其体外稳定性。

2 结果与讨论

2.1标记前体(3)的合成表征

文献报道胆汁酸类化合物在甾核的C-3和C-24进行结构修饰后，依然能被其特异性受体识别。据此，通过一步反应设计制备了标记前体(3)，即在LCA的C-24上引入了端炔基，从而可以利用点击化学反应Cu(I)催化的叠氮化物与端炔的1,3偶极环加成反应(CuAAC)来实现石胆酸的18F标记。标记前体的结构经质谱、核磁氢谱和碳谱表征确认。TOF-ESI-MS:M(C27H43NO2)=413.64(m/z)，414.4[M+H]+，436.4[M+Na+]，827.8[2M+H+]，849.8[2M+Na+]。13C NMR(CDCl3)，δ：12.06、18.39、20.83、23.38、24.21、26.42、27.20、28.26、29.19、30.56、31.57、33.31、34.58、35.35、35.45、35.86、36.47、40.19、40.44、42.10、42.76、55.98、56.51、71.56、71.89、79.69、173.11。1H NMR(CDCl3)，δ：5.64(br s，1H，NH)，4.06(d，1H，C25-αH，J=2.4 Hz)，4.04(d，1H，C25-βH，J=2.4 Hz)，3.63(m，1H，C3—H)，2.3～0.92(m，32H)，0.92(s，3H，C19—H)，0.64(s，3H，C18—H)。标记前体(3)可获得较高的收率(74.3%)和纯度(大于99%)，满足后面18F标记的应用。

2.2参比化合物的合成([19F]FEA-LCA)

参比化合物的合成参照文献[16]，略有修改。[19F]FEA-LCA通过三步反应制备。点击反应可在室温进行，但需要反应过夜，反应时间较长。通过加热到50 ℃进行此步反应，可极大加快反应速率，且HPLC监测反应无副产物生成，最终产物无需纯化，即可获得较高纯度(纯度大于99%)。三步反应的收率均较高。参比化合物[19F]FEA-LCA用于标记时所用的HPLC分离分析方法的建立和标记产物的确定。

反应产物经质谱、氢谱、碳谱表征确认。对甲苯磺酸氟乙酯(5)，TOF-ESI-MS:M(C9H11FO3S)=218.25(m/z)，241.0[M+Na]+，273.1[M+Na+CH3OH]+。1H NMR(CDCl3)，δ：7.825～7.797(d，2H，Ar—H，J=8.4 Hz)，7.372～7.345(d，2H，Ar—H，J=8.7 Hz)，4.664～4.637(m，1H，—CH—F)，4.507～4.480(m，1H，—CH—F)，4.324～4.297(m，1H，—SO3—CH)，4.234～4.207(m，1H，—SO3—CH),2.455(s，1H，—CH3)。[19F]FEA-LCA，TOF-ESI-MS:M(C29H47FN4O2)=502.71(m/z)，503.55[M+H]+，525.55[M+Na]+。1H NMR(CDCl3)，δ：7.65(s,1H,CH)，6.18(br s,1H,NH)，4.85(t,1H,—CHF,J=4.8 Hz)，4.73(t,1H,—CHF,J=4.8 Hz)，4.68(t,1H,CH,J=4.8 Hz)，4.61(t,1H,CH,J=4.8 Hz)，4.52(d,2H,CH2,J=5.6 Hz)，3.62(m,1H,C3H)，2.25(m,1H,CH)，2.09(m,1H,CH)，1.94(m,1H,CH)，1.9～0.92(m,29H)，0.91(s,3H,C19H)，0.64(s,3H,C18H)。13C NMR(CDCl3)，δ：173.69、145.15、123.17、82.24、80.52、71.88、56.48、55.97、50.67、42.74、42.10、40.43、40.17、35.85、35.48、35.35、34.82、34.58、33.42、31.62、30.55、28.25、27.19、26.41、24.21、23.38、20.82、18.37、12.03。

2.3[18F]FEA-LCA的点击化学合成

由于18F具有优良的核性质和化学性质，其半衰期为109.8 min，能满足多步化学反应的需要，并能监测较慢的生化过程；具有较低的正电子能(649 keV)，易于获得高分辨率的图像，并且临床使用更加安全，因此选择18F对LCA进行了标记合成。

Click合成子[18F]FEA通过对甲苯磺酸叠氮乙酯(6)与18F-亲核取代反应制备，并采用氮气辅助蒸馏纯化。通过优化蒸馏温度(由95 ℃降低为85 ℃)可以减少叠氮前体6的蒸出，从而提高了合成子[18F]FEA的比活度，该步放射化学产率为68%～75%(n=5，衰变校正，含蒸馏步)，比活度大于150 PBq/mol。[18F]FEA合成简单，放射化学产率和比活度高，纯化方法简单快速，纯化后可获得高比活度的产品，对于下一步的Click反应极为有利。

[18F]FEA-LCA通过化合物3与[18F]FEA在Cu(I)催化下通过点击化学反应制备，反应只需要15 min，标记率大于96%。该法不需要保护基，避免了羟基的保护和脱保护反应。并且由于CuAAC反应具有极高的化学选择性和优越的区域选择性，反应中没有明显的放射性副产物生成。[18F]FEA-LCA通过与参比化合物产物[19F]FEA-LCA共同HPLC进样分析确认(图4)。通过半制备HPLC纯化，放射化学产率为90%～95%(n=3，从[18F]FEA计，衰变校正)，两步反应放射化学产率为66%～74%(n=3，从18F-计，衰变校正)。[18F]FEA-LCA的放射化学纯度(>99%)和比活度(>300 PBq/mol)均较高。[18F]FEA-LCA总合成时间为70～85 min(含HPLC纯化时间)。通过点击化学对LCA进行18F标记的方法高效可靠，适合于大规模生产。

2.4脂水分配系数

[18F]FEA-LCA的脂水分配系数lgD7.4=1.78±0.05(n=2)，保持了胆汁酸类化合物的亲脂性。因此[18F]FEA-LCA具有其母体化合物LCA相似的性质。

(a)——紫外谱图(UV trace)，(b)——放射性谱图(γ-trace)

新生牛血清中(In NBCS)：(a)——30 min，(b)——60 min，(c)——180 min；PBS中(In PBS)：(d)——30 min，(e)——60 min，(f)——180 min

2.5体外稳定性

37 ℃下，[18F]FEA-LCA在新生牛血清和PBS中分别孵育30、60、180 min，其HPLC图示于图5。由图5可知，均未发现脱氟或放射性降解产物，表明[18F]FEA-LCA具有良好的体外稳定性。这对于显像剂进一步的体内评价奠定了基础。

3 结 论

通过合成含端炔基的标记前体，并采用点击化学的方法制备得到了一种潜在的靶向TGR5的PET分子显像探针([18F]FEA-LCA)。其制备简单快速，具有较高的放射化学产率、比活度和放射化学纯度。[18F]FEA-LCA具有其母体化合物LCA相似的亲脂性，并具有良好的体外稳定性，无明显的脱氟或降解现象，为该PET探针进行进一步的体内评价奠定了良好的基础。

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SynthesisandPreliminaryEvaluationof18F-LabeledBileAcidCompoundforTGR5

JIA Li-na1, 2, JIANG Da-wei1, 2, CHENG Deng-feng3, ZHANG Lan1,*

1.Department of Radiochemistry and Engineering, Shanghai Institute of Applied Physics, Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201800, China; 2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 102413, China; 3.Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

G protein-coupled receptor (TGR5) is a cell-surface bile acid receptor which is closely related to glucose metabolism, energy expenditure and the secretion of glucagon-like peptide-1. TGR5 is a potential target for diagnosis, treatment and prognosis evaluation of the tumors, whose expression is strongly upregulated in many tumors compared to expression levels in normal tissues and is associated with the prognosis of the patients. Therefore, the18F-PET probe [18F]FEA-LCA was prepared with the simply and efficiency click chemistry method with a high radiochemical yield (66%-74%), high radiochemical purity (>99%), and high specific activity (>300 PBq/mol). [18F]FEA-LCA has a similar lipophilicity to the parental bile acid lithocholic acid and a high metabolic stabilityinvitro. This work make a solid foundation for further study the [18F]FEA-LCA as the PET probe to the tumors of TGR5-overexpression.

bile acid; TGR5;18F; lithocholic acid; PET imaging

2013-11-27；

2014-01-20

国家自然科学基金资助项目(No.10875163)

贾丽娜(1985—)，女，河北唐山人，博士研究生，主要从事放射性药物研究

*通信联系人：张 岚(1974—)，男，安徽淮南人，博士，研究员，主要从事放射性药物研究，E-mail: zhanglan@sinap.ac.cn

R817

A

0253-9950(2014)04-0247-06

10.7538/hhx.YX.2014.2013076