王淑琴，李润成，黎 硕

（湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128）

湖南耒阳某猪场自2012年9月份开始，50～80日龄的保育猪陆续出现体温升高、4 0℃左右，皮毛粗乱、食欲减退、消瘦、呼吸困难、发病后期四肢关节肿大，不能站立的情况。发病率2 0%～3 0%左右，使用各种抗生素预防和治疗效果均不明显，保育舍小猪总死亡率达1 0%左右，没有死亡的小猪多数变成僵猪，生长速度缓慢、精神状态不佳。

由于该猪场小猪没有进行过蓝耳病毒、圆环病毒疫苗接种，根据临床症状，兽医怀疑猪群存在蓝耳病毒、圆环病毒感染，同时可能混有细菌的继发感染，采集了1 4日龄、3 0日龄、4 0日龄、6 0日龄、7 0日龄的小猪血液以及随机挑取4头发病小猪进行实验室诊断。对7份1 4日龄小猪的血液以及3 0、4 0、6 0日龄小猪的血液各8份检测了蓝耳病毒抗体，并根据群体大小抽取了7份1 4日龄小猪血液、8份40日龄小猪的血液、8份6 0日龄小猪的血液、8份7 0日龄小猪的血液检测了圆环病毒抗体，此外，还对4头发病保育猪的病料检测了猪瘟、蓝耳病毒。结果发现该猪场保育猪群在14～3 0日龄期间感染了蓝耳病毒，但没有表现出发病症状，直到5 0～8 0日龄出现圆环病毒感染后才表现出明显发病表现，且多数病猪存在链球菌的继发感染。现报告如下：

1 试验材料与方法

1.1 检测样本

3 9份小猪血液（其中7份1 4日龄小猪的血液、8份3 0日龄小猪的血液、8份40日龄小猪的血液、8份6 0日龄小猪的血液、8份7 0日龄小猪的血液），4份来自5 0～8 0日龄发病小猪的病料。

1.2 抗体检测试剂盒

蓝耳病毒抗体检测试剂盒购自美国IDEXX公司，圆环病毒抗体检测方法为本实验室构建而成，见文献[1]。

1.3 分子生物学检测主要试剂

Taq酶，dNTP、DNA Marker购自大连宝生物，反转录试剂盒购自Fermentes，TRIZOL试剂购自Invitrogen公司

1.4 不同日龄断小猪的临床观察及解剖病猪的病理变化分析

1.4.1 临床表现观察

对没有断奶的哺乳仔猪、刚断奶的仔猪、5 0～6 0日龄的断奶仔猪、7 0～8 0日龄的断奶仔猪进行临床观察，比较不同年龄段小猪的健康状况。

1.4.2 病理解剖观察

解剖发病小猪观察小猪各脏器的病理变化情况。

1.5 血清抗体检测

1.5.1 蓝耳病毒抗体检测

根据群体大小选取7份1 4日龄小猪的血液，以及3 0、4 0、6 0日龄小猪的血液各8份检测蓝耳病毒抗体，具体操作按试剂盒说明进行。

1.5.2 圆环病毒抗体检测

根据群体大小抽取了7份1 4日龄小猪血液、8份4 0日龄小猪的血液、8份6 0日龄小猪的血液、8份7 0日龄小猪的血液检测了圆环病毒抗体，具体操作见文献[1]

1.6 猪瘟病毒、蓝耳病毒检测

用猪瘟病毒、蓝耳病毒检测的特异性引物，引物资料见文献[2，3]，以提取并经反转录得到的基因组cDNA为模板，进行病毒的特异性检测。RNA的提取及反转录按常规2步法进行操作。

1.7 检测结果统计

以不同日龄段小猪蓝耳病毒以及圆环病毒抗体水平平均S/P值做散点分布图，图中1个点代表1个年龄断小猪的平均抗体水平，并在散点图中绘出小猪临床发病日龄区间，分析小猪发病日龄与抗体变化之间的关系。

1.8 细菌的分离与鉴定

细菌分离与鉴定方法见文献[4]。

2 结果

2.1 不同日龄段小猪的临床观察及解剖、病理学观察结果

2.1.1 临床表现观察结果

通过观察不同日龄的小猪健康状况，该猪场小猪在断奶前，断奶后的30日龄、50～60日龄临床表现健康状况良好，但到70～80日龄则表现出消瘦、皮毛粗乱等明显的发病症状。具体见图1、2、3、4。

2.1.2 解剖、病理学观察结果

解剖小猪发现，发病早期的小猪内脏病理变化，除有肺炎变化外、仅见到腹股沟、肠系膜淋巴结肿大，其他病变均不明显；发病晚期的小猪除外表皮毛粗乱、消瘦外，关节可见积液、胸腹腔有纤维素性渗出物、肠系膜淋巴结明显肿大，见图5、6、7。

2.2 蓝耳病毒抗体检测结果

根据群体大小选取7份1 4日龄小猪的血液以及3 0、4 0、6 0日龄小猪的血液各8份检测蓝耳病毒抗体，由表1可见该猪场小猪1 4日龄时母源抗体下降，部分小猪蓝耳病毒抗体已变为阴性，没有蓝耳病毒抗体，但3 0日龄的小猪蓝耳病毒抗体又基本变为阳性，平均S/P值达到1.1 7，阳性率为8 6%，4 0、6 0日龄的小猪随日龄增加而抗体水平变得更高，6 0日龄时抗体水平平均S/P值达1.7 8，阳性率为1 0 0%。

2.3 圆环病毒抗体检测结果

根据群体大小选取7份1 4日龄小猪的血液，以及3 0、4 0、6 0日龄小猪的血液各8份检测圆环病毒抗体，结果见表2，由表2可见该猪场小猪1 4日龄时，小猪圆环病毒母源抗体仍然较好，平均S/P值为0.9 2，阳性率1 0 0%，到7 0日龄时已基本转为阴性，少数个体圆环病毒抗体水平达到了一个很高的水平，S/P值达到2.0以上，个体间抗体水平很不整齐，变异系数达到1.7 2的高度。

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2.4 猪瘟病毒、蓝耳病毒检测

用猪瘟病毒、蓝耳病毒检测的特异性引物，以提取的基因组为模板进行病毒的特异性检测。结果见图8、9，由图8可见只有阳性对照扩增出了232bp的特异性条带，由图9可见4份病料有3份扩增出了218bp的特异性条带。

2.5 检测结果统计情况

以不同日龄段小猪蓝耳病毒以及圆环病毒抗体水平平均S/P值做散点分布图，并在散点图中绘出小猪临床发病日龄区间，由图1 0可见在小猪蓝耳病毒抗体转阳后，圆环病毒抗体转阳过程50～80日龄小猪表现出了明显的发病症状。

2.6 细菌分离鉴定结果

用关节腔内病变积液及肺脏深部组织接种鲜血琼脂培养基和巧克力琼脂培养基，培养48h后观察细菌生长形态，结果两种培养基均长出了大量相同形态的细菌，鲜血琼脂培养基上有呈β溶血特性；挑取菌落涂片革兰氏染色镜检，结果见图11。由图11可见大量革兰氏阳性、两两连在一起或呈短链的球状细菌。以纯培养的细菌为模板，用设计的细菌16SrRNA通用引物扩增分离菌株的16SrRNA基因序列，PCR产物测序结果通过BLAST分析表明该细菌为猪链球菌。

3 讨论与分析

3.1 由于该猪场没有给小猪接种蓝耳病毒疫苗，从不同日龄段的小猪群蓝耳病毒抗体变化情况可见，小猪群在14～30日龄阶段经历了蓝耳病毒感染，且通过对5 0～80日龄发病小猪的病毒检测也证明了小猪群中携带有蓝耳病毒。但该猪群在14～40日龄阶段并未表现出发病，可能是由于该猪场饲养管理比较精细没有其他病原的继发感染，是蓝耳病毒的感染并没有对生猪造成较大损害的缘故。

3.2 该小猪群1 4日龄时，小猪圆环病毒母源抗体较好，平均S/P值为0.92，阳性率100%。40日龄时，小猪圆环病毒抗体出现了阴性个体，阳性率开始下降，到7 0日龄时已基本转为阴性，抗体阳性率只有25%，且少数几个抗体阳性的个体，圆环病毒抗体达到了很高的水平，S/P值在2.0以上，应该是野毒感染后产生。由于该阶段小猪个体间抗体水平很不整齐，变异系数在1.72以上，说明该阶段小猪群圆环病毒感染比较活跃。

3.3 根据蓝耳病毒、圆环病毒抗体检测结果结合病原检测以及临床用药效果情况，可见该次保育舍50～80日龄的10%的个体出现消瘦，体况变差的现象应该主要是由圆环病毒、蓝耳病毒共同感染造成。至于发病小猪的关节积液、胸腹腔大量渗出物是链球菌继发感染引起。猪场方采取给小猪接种蓝耳病毒疫苗和圆环病毒疫苗后使猪病得到了明显的控制，接种疫苗的小猪没有再出现类似的发病表现。该论文说明了小猪群在单一的感染蓝耳病毒的情况下，如果饲养管理到位，动物营养水平供应均衡、充足，且没有继发感染的情况下很可能不会出现严重的临床发病表现，但蓝耳病毒与圆环病毒合并感染则具有协同致病作用，导致免疫力大幅度下降，很快继发一系列并发症，出现多系统衰竭综合征。表现发热、拉稀、喘气、神经症状等，发病率和死亡率较高。因此，笔者建议养猪人注意猪场饲养管理的重要性，在控制蓝耳、圆环病毒感染的情况下，增强生猪的体质、控制其他病原的继发感染。以减少盲目使用抗生素带来的养殖成本增加和病原耐药性的过度发展。 □

[1] 葛 猛,屈泰龙,罗维,等.利用圆环病毒2结构蛋白建立检测其抗体的间接ELISA方法[J].2013,(1):63-66.

[2] 向卫军,李润成,颜运秋,等.母猪猪瘟持续性感染引起仔猪死亡的诊断[J].湖南畜牧兽医,2009,(3):18.

[3] 李 波,李润成,肖博仁,等.一例母猪混合感染猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪丹毒杆菌的实验室诊断及药物敏感性实验[J].猪业科学，2011,(8):90-91.

[4] 恭烨,洪厚成,李润成.断奶仔猪马链球菌兽疫亚种感染的诊断及防治[J].湖南畜牧兽医.2012,(2):15-16.