束建花，郭红艳，王立琦，高 艳，曾振灵

(华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510642)

呋喃它酮代谢物人工抗原的合成及抗体的制备

束建花，郭红艳，王立琦，高 艳，曾振灵

(华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510642)

呋喃它酮代谢物； 半抗原； 多克隆抗体； 酶联免疫测定法

目前用于呋喃它酮残留的仪器检测方法主要有LC-MS[5]、LC-MS/MS[6].尽管该类检测方法有很高的灵敏度和准确性，但所需仪器昂贵、操作复杂、耗时久，难以应用于大规模的筛选检测.相对来说，免疫检测法具有简便、快速、高灵敏和高特异性等优点，在国内外兽药、农药残留检测中得以广泛应用，尤其是ELISA法.Pimpitak等[7]利用制备的AMOZ单克隆抗体建立了检测虾中AMOZ残留的ic-ELISA方法，以CPAMOZ为竞争物，IC50值为(1.19±0.03) ng·mL-1.Diblikova等[8]以直链作间隔臂合成了新型半抗原，制备的抗体对AMOZ并无抑制率，经分析半抗原分子结构不稳定、空间构象过于简单及间隔臂封闭作用都可能是导致抗体无特异性的因素.本研究旨在以CPAMOZ-BSA和AMOZ-BSA为免疫原对Babl/c小鼠进行免疫，通过ic-ELISA方法测定鼠血清多抗克隆特性，对结果进行比较分析，筛选出最佳的免疫原和包被原组合，为进一步制备单克隆抗体和提高动物性食品中AMOZ残留检测的ic-ELISA方法的灵敏度奠定基础.

1 材料与方法

1.1 试验动物

健康雌性SPF级Balb/c小鼠，4～6周龄，购自广东省实验动物中心，饲养于华南农业大学国家兽药残留基准实验室动物观察室.

1.2 试剂与药品

AMOZ由华南农业大学兽医学院药理实验室合成；戊二醛为上海凌峰化学试剂有限公司产品；牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)为上海金穗生物科技有限公司产品；对醛基苯甲酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)均为阿拉丁试剂公司产品；AMOZ标准品、FTD标准品、NPAMOZ标准品、羊抗鼠IgG-HRP、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂为美国Sigma公司产品.

1.3 主要仪器与设备

旋转蒸发仪(上海爱朗仪器)，液相色谱串联质谱联用仪(安捷伦6430)，紫外/可见分光光度计(岛津公司)，酶联免疫检测仪(Thermo scientific公司)，离心机(Thermo scientific公司)，磁力搅拌器(巩义市予华仪器厂).

1.4 免疫原AMOZ-BSA、包被原AMOZ-OVA的制备

在安装有磁力搅拌器装置的烧杯中加入16.8 mg BSA 和1 mL PBS(0.05 mol·L-1，pH=7.4)，称取5.3 mg AMOZ溶于0.4 mL PBS(0.05 mol·L-1，pH=7.4)，待BSA完全溶解后加入已溶解完全的AMOZ溶液，搅拌过程中将30 μL戊二醛溶液逐滴加入，反应过程中可见反应液颜色逐渐变深至青黄色，室温反应2 h后置于冰水浴中.称取25 mg NaBH4分批加入上述反应液，约20 min后反应液颜色逐渐褪去，室温反应2 h，合成路线见图1.收集偶联后的溶液，装入相对分子质量为12 400的透析袋中，4 ℃搅拌条件下用3 L PBS(0.015 mol·L-1，pH=7.4)缓冲液透析3 d，每天更换透析液2次.透析完成后，离心取上清液，得到的完全抗原分装于1 mL离心管中，冻存于-20 ℃条件下备用.

包被原AMOZ-OVA偶联物的制备方法同免疫原AMOZ-BSA的制备.

1.5 免疫原CPAMOZ-BSA、包被原CPAMOZ-OVA的制备

CPAMOZ的合成与鉴定：称取100 mg AMOZ于25 mL干燥圆底烧瓶中，用3 mL甲醇溶解，搅拌升温至60 ℃，再加入156 mg 对醛基苯甲酸，反应3 h，反应过程中用薄层色谱法(Thin layer chromatography，TLC)跟踪反应进程[展开剂为V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)=9∶1].用甲醇洗涤沉淀，烘干后得到白色粉末即为CPAMOZ.取少量CPAMOZ，用甲醇溶解，经ESI-MS质谱鉴定.

免疫原CPAMOZ-BSA的合成：取0.01 mmol的CPAMOZ溶解于0.2 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再分别加入0.15 mmol EDC·HCl和0.15 mmoL NHS，室温搅拌反应6 h，得溶液a.取30 mg BSA溶于10 mL PBS(pH=7.4，0.1 mol·L-1)，得溶液b.0～4 ℃搅拌，将溶液a逐滴加入溶液b中，反应过夜，合成路线见图2.透析方法同1.4.

包被原CPAMOZ-OVA偶联物的制备方法同免疫原CPAMOZ-BSA的制备.

图1 以AMOZ作半抗原合成人工抗原的路线图Fig.1 The synthesized scheme of artificial antigens for AMOZ

图2 以CPAMOZ作半抗原合成人工抗原的路线图Fig.2 The synthesized scheme of artificial antigens for CPAMOZ

1.6 免疫原的鉴定

在200～400 nm紫外光区对等浓度的AMOZ-BSA和CPAMOZ-BSA溶液、BSA溶液、AMOZ和CPAMOZ溶液进行光谱扫描，并测定完全抗原载体蛋白和半抗原最大吸收波长处的吸光度，比较特征吸收峰与吸收曲线，初步鉴定人工抗原是否偶联成功.

1.7 动物免疫试验与抗体测定

1.7.1 动物免疫试验 取6只5～6周龄的雌性Balb/c小鼠随机均分为2组，编号I和II组，分别免疫CPAMOZ-BSA和AMOZ-BSA，免疫剂量50 μg/只(以蛋白质量计算).首免：免疫原稀释至1 mg/mL，与100 μL弗氏完全佐剂等量混合(体积比1∶1)，充分乳化，Balb/c小鼠背部皮下4点注射；每隔14 d加强免疫1次，将弗氏完全佐剂换成弗氏不完全佐剂，其余操作同首免.第4次加强免疫7 d后，取鼠尾血在4 ℃条件下12 000 r/min离心5 min后收集尾血血清，用ELISA和ic-ELISA检测尾血血清效价及对AMOZ和NPAMOZ的抑制率.

1.7.2 多克隆抗体效价测定 采用ELISA测定血清效价，抗血清D450 nm(P)与相同稀释度阴性对照血清D450 nm(N)之比P/N>2且P>1.0的最大稀释度为抗AMOZ的多克隆抗体的效价.取D450 nm为1.0左右的抗体稀释度进行ic-ELISA试验，测定多克隆抗体灵敏度.

1.7.3 多克隆抗体灵敏度测定 以CPAMOZ-OVA 和AMOZ-OVA为包被原做ic-ELISA鉴定多克隆抗体特异性.分别以100.000、10.000、5.000、1.000、0.500、0.100、0.010、0.001 ng·mL-1的AMOZ、NPAMOZ标准溶液和包被抗原竞争与多克隆抗体结合反应.以相应浓度竞争物抑制时的D450 nm(B)与无竞争物抑制时的D450 nm(B0)的比值(B/B0)为纵坐标，以标准品不同质量浓度为横坐标，运用四参数法拟合曲线，推导出回归方程，根据回归方程式计算出NPAMOZ的IC50，同时比较不同抗体特异性的高低.

1.7.4 交叉反应测定 用梯度稀释的呋喃唑酮、呋喃唑酮代谢物(AOZ)、呋喃西林、呋喃西林代谢物(SEM)、呋喃妥因、呋喃妥因代谢物(AHD)、对硝基苯甲醛、对羧基苯甲醛作为抑制物，用ic-ELISA 测定各抑制物在不同浓度的D450 nm，分别作抑制曲线，根据拟合曲线计算各药物的IC50，然后按照公式计算交叉反应率(CR)：CR =(NPAMOZ的IC50/其他抑制物的IC50)×100%.

2 结果与分析

2.1 CPAMOZ的鉴定

CPAMOZ的质谱图见图3，其理论相对分子质量为333.1，从质谱图分析CPAMOZ的[M+H]+为334.2，CPAMOZ的[M-COOH+H+H]+为290.2，都与理论相对分子质量相符合.结果表明CPAMOZ合成成功.

图3 半抗原CPAMOZ的质谱图Fig.3 The mass spectrum of CPAMOZ

2.2 免疫原的鉴定

由紫外分光光度法鉴定免疫原的合成是否成功.CPAMOZ-BSA的紫外图谱见图4，由于CPAMOZ结构中含有苯环，在紫外区(波长200～400 nm)有一定吸收峰，图4中CPAMOZ在291.5 nm处有最大吸收峰.当它连接到蛋白质载体上时，载体蛋白的紫外吸收特征将发生改变.因此，图4中载体蛋白BSA在278 nm处有最大吸收峰，而免疫原CPAMOZ-BSA的最大吸收峰在290.5 nm处，表明偶联后吸收峰发生了漂移，初步判断CPAMOZ-BSA偶联成功.AMOZ-BSA的紫外图谱见图5，由于AMOZ分子中无苯环，因此在紫外区(波长200～400 nm)的吸收峰较为平坦，但AMOZ与BSA通过戊二醛法偶联生成了西佛碱结构，从而偶联物AMOZ-BSA(未还原)在265 nm处有明显吸收峰，但西佛碱结构被NaBH4还原成碳氮单键后在紫外区的吸收峰大大降低，AMOZ-BSA(还原)峰形与BSA的相似(图5)，在277 nm处有最大吸收峰，由此进一步证明了还原成功.

图4 CPAMOZ-BSA紫外扫描图谱Fig.4 Ultraviolet scanning of CPAMOZ-BSA

图5 AMOZ-BSA紫外扫描图谱Fig.5 Ultraviolet scanning of AMOZ-BSA

2.3 抗体特异性的测定

2.3.1 效价测定 取4免后的小鼠血清，分别用相应的包被原做ELISA试验，测定不同稀释度小鼠血清的D450 nm，结果见图6.免疫原CPAMOZ-BSA和AMOZ-BSA可诱导Ⅰ组、Ⅱ组小鼠产生抗体，其中Ⅰ组的血清抗体效价比较高，均达到1∶16×104以上，最高的达1∶32×104以上；II组的血清效价则普遍相对较低，仅达到1∶4×104以上.以上现象可能是由于CPAMOZ-BSA间隔臂中的苯环结构是强势基团，可刺激机体产生较强的免疫应答反应，因此产生的抗体效价普遍较高.同理，由于AMOZ-BSA间隔臂是碳直链，对机体影响较小，因此诱导产生的抗体效价偏低.

图6 ELISA测定I、II组小鼠血清多克隆抗体效价

Fig.6 Determination of the duliton of polyclonal antibodies from group Ⅰ and group Ⅱ by ELISA method

2.3.2 灵敏度测定 将2种鼠血清多克隆抗体与合成的2种包被原进行配对组合，以AMOZ、NPAMOZ为竞争物，用ic-ELISA法测定不同组合IC50，结果(表1)可见，以AMOZ作为竞争物时，4种组合对AMOZ的IC50>200 ng·mL-1，无明显抑制.以NPAMOZ为竞争物时，AMOZ-BSA诱导产生的II组抗体对NPAMOZ的IC50>200 ng·mL-1，也无明显抑制；而CPAMOZ-BSA诱导产生的I组抗体，与同源性包被原CPAMOZ-OVA组合配对时，IC50=11.49 ng·mL-1，与异源性包被原AMOZ-OVA组合配对时，IC50=4.53 ng·mL-1，灵敏度明显提高.分析对比试验结果表明:1)AMOZ作半抗原时相对分子质量太小且结构简单，制备的免疫原AMOZ-BSA无法诱导机体产生针对AMOZ的高特异性抗体;2)CPAMOZ作半抗原时，由于其结构中含有强势基团苯环且CPAMOZ与NPAMOZ结构相似，因此刺激机体产生的抗体对NPAMOZ同样具有特异性;3)Ⅰ组抗体与不同包被原组合的ic-ELISA标准曲线(图7)表明，抗体与异源性的包被原配对，能使灵敏度得到较大程度的提升，这可能是由于CPAMOZ-BSA诱导产生的抗体对NPAMOZ识别度比AMOZ高，因此以NPAMOZ为竞争物、AMOZ-OVA为包被原时，NPAMOZ的竞争能力提高，从而IC50降低，灵敏度提高.

表1 ic-ELISA对抗体特异性的测定

1)N：表示无明显抑制作用，IC50>200 ng·mL-1.

2.4 交叉反应率测定

以包被原AMOZ-OVA为基础，采用ic-ELISA方法测定抗体特异性.结果(表2)可见,抗体与CPAMOZ、AMOZ、FTD等有交叉反应，交叉反应率分别为78.6%、1.5%和4.6%，与其他结构相近的药物及其代谢物等基本无交叉反应.

B0为无竞争物抑制时的D450 nm,B为相应浓度竞争物抑制时的D450 nm.

图7 多克隆抗体与不同包被原组合的ic-ELISA标准曲线

Fig.7 The standard curves of ic-ELISA about different anti-body/coat antigen combinations

表2 抗体与其他药物的交叉反应

3 讨论与结论

AMOZ的相对分子质量仅为201，属于小分子化合物，只具有反应原性而不具有免疫原性，因此必须与大分子载体物质偶联.本研究为探讨AMOZ分子直接与载体蛋白BSA偶联是否可诱导动物机体产生针对AMOZ的特异性抗体，将AMOZ与BSA通过戊二醛法偶联，虽然戊二醛法较为常见[9-10]，但其生成物的间隔臂较长且含有西佛碱结构，结构稳定性较差，本文通过NaHB4将西佛碱结构还原使生成物转变成更稳定的免疫原AMOZ-BSA.另外，又以AMOZ与对醛基苯甲酸反应合成CPAMOZ，通过活性酯法将CPAMOZ与BSA偶联得免疫原CPAMOZ-BSA[11].免疫原AMOZ-BSA与CPAMOZ-BSA的结构区别主要在于间隔臂的立体结构是否复杂.本试验采用2种包被原通过ic-ELISA方法对2种免疫原诱导产生的抗体的特性进行测定，对比两者结果发现，以AMOZ为竞争物时，无论采用同源性或者异源性包被方式，ic-ELISA的IC50>200 ng·mL-1，远远达不到中国零残留检测的要求和欧盟的要求[12].据分析导致抑制率差是由于AMOZ相对分子质量太小且立体结构不够复杂，无法刺激动物机体产生对AMOZ有高特异性的抗体.然而CPAMOZ-BSA结构中含有苯环较为复杂，可诱导机体产生对NPAMOZ的特异性抗体，并且通过与异源性包被原AMOZ-BSA配对，测得I组鼠血清多克隆抗体效价为1∶32×104，IC50=4.53 ng·mL-1，灵敏度比同源性配对法高2倍多,表明抗原抗体的异源性配对能提高ELISA方法的灵敏度，这与已有的文献[13]报道相符.从而为其单克隆抗体的制备和ic-ELISA方法灵敏度的提高建立了良好的基础，并且这也为环境、食品中残留农药的快速检测提供一定的参考.

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【责任编辑柴 焰】

Synthesisofartificialantigensandpreparationforspecificantiseraagainst3-amino-2-oxazolidinone，ametaboliteoffuraltadone

SHU Jianhua，GUO Hongyan，WANG Liqi，GAO Yan，ZENG Zhenling

(College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

【Objective】To establish a high sensitivity enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of furaltadone.【Method】Furaltadone metabolite (3-amino-5-morpholinomethyl- 2-oxazolidinone, AMOZ) was coupled to carrier proteins (bovine serum albumin or ovalbumin) and reduced with NaBH4for the production of immunogen AMOZ-BSA and coating antigen AMOZ-OVA through glutaraldehyde method. With 4-carboxybenzaldehyde for derivatization reagent, AMOZ was made into CPAMOZ, which was successfully conjugated to carrier proteins according to the active ester method to form CPAMOZ-BSA, CPAMOZ-OVA. UV scanning showed that antigens were successfully linked to carrier proteins. After immunizing animal (Balb/c mice), polyclonal antibody against NPAMOZ was produced. 【Result and conclusion】 Antibody was diluted at 1∶32×104and the IC50value was 4.53 ng·mL-1. The cross-reactivity (CR) of the antibody with CPAMOZ, AMOZ and furaltadone was 78.6%, 1.5% and 4.6% respectively. There is almost no CR with other three nitrofurans and their metabolites, which indicates a high selectivity of the antibody.

furaltadone metabolite; hapten； polyoclonal antibody; enzyme-linked immunosorbent assay

2013- 05- 31优先出版时间2014- 01- 03

优先出版网址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20140103.0830.022.html

束建花 (1988—)，女，硕士研究生，E-mail: 386126805@qq.com；通信作者：曾振灵 (1963—)，男，教授，博士，E-mail: zlzeng@scau.edu.cn

农业部兽药质量安全监管项目(农财发[2012]36号)

束建花，郭红艳，王立琦，等.呋喃它酮代谢物人工抗原的合成及抗体的制备[J].华南农业大学学报，2014,35(2):18- 23.

S511； S502

A

1001- 411X(2014)02- 0018- 06