郭立霞 徐育冬 王浩 朱明华

·论著·

肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对佐剂性关节炎大鼠滑膜中TNF-α、TGF-β1和VEGF表达的影响

郭立霞 徐育冬 王浩 朱明华

目的探讨肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对佐剂性关节炎大鼠滑膜中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1 (TGF-β1)血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法将成年雄性Wistar大鼠随机分为5组，Ⅱ～Ⅴ组建立佐剂性关节炎大鼠(AA)模型，于造模后第12天开始Ⅲ组给予甲氨喋呤灌胃治疗，Ⅳ～Ⅴ组给予益赛普皮下注射治疗。第28天取膝关节滑膜，常规HE染色，计算滑膜病理积分，免疫组织化学染色检测TNF-α、TGF-β1和VEGF在膝关节滑膜的表达。结果正常对照组大鼠滑膜组织均有少量TNF-α、TGF-β1和VEGF的表达，Ⅱ～Ⅴ组较Ⅰ组均明显增高(P<0.05)。Ⅳ、Ⅴ组滑膜组织TNF-α表达较Ⅱ组明显减低(P<0.05)，而Ⅲ组与Ⅱ组无统计学意义(P>0.05)。Ⅲ～Ⅴ组滑膜组织TGF-β1、VEGF的表达均明显低于Ⅱ组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论可溶性重组人肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白可明显降低AA大鼠滑膜组织TNF-α、TGF-β1和VEGF表达，对AA大鼠的关节炎症有明显的治疗作用，可能抑制局部组织血管新生。

佐剂性关节炎大鼠；可溶性重组人肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(益赛普)；肿瘤坏死因子-α；转化生长因子-β1；血管内皮生长因子

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性进行性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎，对称性和破坏性关节病变为主要特征。血管新生促进滑膜血管翳的发生和发展，维持血管翳的侵袭性，促进软骨和骨破坏及关节重塑，最终造成关节畸形、强直和功能丧失。TGF-β属于生长因子超家族，具有调节创伤愈合、成纤维细胞增生和血管新生等功能，VEGF是促进血管新生的关键因子，可能在RA发病机制中起重要作用。在细胞因子相互作用的网络中TNF-α居于中心位置，是RA滑膜炎发生和持续的一个关键性因子[1]。益赛普(肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白)是一种拮抗TNF-α的生物制剂，目前已应用于临床，治疗效果优于传统的抗风湿药。但国内对于益赛普能否抑制促进血管增生的细胞因子TGF-β1、VEGF分泌罕有报道。本试验以佐剂诱导的关节炎大鼠模型为基础，观察益赛普对关节炎的影响，评价其疗效，探讨益赛普治疗RA的机制、临床应用价值及其对滑膜组织血管增生的抑制情况。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 动物 Wistar大鼠90只，雄性，体重140～160 g，由河北省实验动物中心提供，合格证号 802120，许可证号SCXK(冀) 2003-1-003。完全弗氏佐剂(FCA，10 ml)购于Sigma公司，卡介苗(BCG，50 mg/支) 购自华瑞创新生物科技开发中心。TNF-α免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物制品公司，TGF-β1、VEGF免疫组化成套试剂盒购自晶美生物制品公司。

1.2 分组及AA大鼠模型的建立 将90只雄性Wistar大鼠采用数字表法随机分为5组，分别编号Ⅰ～Ⅴ组，Ⅰ组10只，Ⅱ～Ⅴ组，每组20只。Ⅰ组为正常对照组，Ⅱ组为单纯造模组，Ⅲ组为造模+甲氨喋呤组，Ⅳ组为造模+益赛普低剂量组(0.44 mg/kg)，Ⅴ组为造模+益赛普高剂量组(0.88 mg/kg)。将FCA与卡介苗配置为含BCG 10 mg/ml 的水包油乳剂。试验第一天在第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组大鼠的尾根部皮内注射该乳剂0.2 ml致炎，诱发佐剂性关节炎。而正常对照组大鼠的尾根部皮内注射等量0.9%氯化钠溶液。

1.3 给药 于致炎后第12～23天Ⅳ、Ⅴ组皮下注射益赛普，Ⅳ组予以益赛普0.44 mg·kg-1·d-1，Ⅴ组予以益赛普0.88 mg·kg-1·d-1。给药容积均为0.1 ml/100 g，连续12 d。Ⅲ组大鼠给予甲氨喋呤2.7 mg·kg-1·周-1灌胃，Ⅱ组大鼠蒸馏水灌胃0.5 ml·只-1·d-1；给药时间均固定在每天上午9∶00。

1.4 病理学及免疫组织化学检测 于致炎后第28天，处死所有大鼠并取膝关节滑膜组织，置于4%多聚甲醛固定液中固定，以备作病理及免疫组织化学检测。常规HE染色并计算滑膜病理积分，按照程度不同分别评分[2]：0分：正常；1 分：极少炎性细胞浸润或(和)组织轻微水肿；2分：轻微浸润；3分：中等浸润；4分：明显浸润；5分：严重浸润。免疫组化检测用SABC (链霉亲和素生物素酶复合物)法，TNF-α、TGF-β1和VEGF阳性滑膜细胞均呈颗粒状棕黄色或棕褐色。采用真彩色图像分析系统对TNF-α、TGF-β1和VEGF表达强度进行定量分析。方法[3]如下：每张切片随机选取5个视野(×200)，系统自动测量出阳性染色部位的积分光密度(IOD)，5个视野的平均IOD值代表该切片TNF-α、TGF-β1和VEGF的表达情况。

1.5 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，采用单因素方差分析，相关性采用直线相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 第Ⅱ～Ⅴ组大鼠造模后共有38只于第15～19天先后出现关节红、肿等关节炎表现，给药期间第Ⅱ组死亡1只，Ⅲ、Ⅳ组各有1只受伤，剔出死亡、受伤及造模不成功的大鼠后，最终入选实验统计结果的实验动物共计45只，Ⅰ、Ⅱ组各10只，Ⅲ、Ⅳ组各9只，Ⅴ组7只。

2.2 大鼠滑膜病理学改变及病理学评分 正常大鼠滑膜衬里层有1～2层滑膜细胞组成，且部分不连续。滑膜衬里层下层为由脂肪细胞、少量成纤维细胞、巨噬细胞和少量血管组成的结缔组织。滑膜组织无炎性细胞浸润，无纤维组织增生。单纯造模组可见滑膜组织中等量淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞浸润，平均病理积分3.8±0.45，滑膜衬里层增生达4～6层。Ⅲ～Ⅴ组滑膜组织病理积分均明显低于Ⅱ组，并具有统计学差异(P<0.01)；Ⅴ组滑膜组织病理积分低于Ⅲ组，且有统计学差异；Ⅳ组滑膜组织病理积分与Ⅲ、Ⅴ组之间无统计学差异(P>0.05)。见表3。

表3 大鼠膝关节滑膜病理学积分

表3 大鼠膝关节滑膜病理学积分

组别分数Ⅰ组(n=10)0Ⅱ组(n=10)3.8±0.4Ⅲ组(n=9)2.8±0.8*Ⅳ组(n=9)2.4±0.6#Ⅴ组(n=7)2.0±0.7#

注：与Ⅱ组比较，*P<0.05，#P<0.01

2.3 滑膜组织TNF-α、TGF-β1和VEGF的表达 正常对照组大鼠滑膜组织均有少量TNF-α、TGF-β1和VEGF的表达。与Ⅰ组相比：Ⅱ～Ⅴ组均明显增高，有统计学意义(P<0.01)。与Ⅱ组相比：Ⅳ、Ⅴ组滑膜组织TNF-α表达较Ⅱ组明显减低，有统计学意义(P<0.01)；Ⅲ组TNF-α表达虽低于Ⅱ组，但无统计学意义。Ⅲ～Ⅴ组滑膜组织TGF-β1、VEGF的表达均明显低于Ⅱ组且有统计学意义(P<0.01)。Ⅳ、Ⅴ组滑膜组织TNF-α表达低于Ⅲ组，有统计学意义(P<0.05)，Ⅴ组滑膜组织TNF-α表达低于Ⅳ且有统计学意义(P<0.05)。Ⅲ、Ⅳ组滑膜组织TGF-β1、VEGF的表达均高于Ⅴ组，有统计学意义(P<0.05)；Ⅲ与Ⅳ组之间无统计学意义(P>0.05)。见表4，图1～8。

表4 大鼠膝关节滑膜组织TNF-α、TGF-β1和VEGF的IOD值

组别TNF-αTGF-β1VEGFⅠ组237±48183±28193±14Ⅱ组1105±186#1020±230#1030±248#Ⅲ组1053±129# 733±125#△ 668±129#☆Ⅳ组 835±109#☆ 709±118#☆ 641±108#☆Ⅴ组 661±84#☆ 499±99#☆ 440±62*☆

注：与Ⅰ组比较，*P<0.05，#P<0.01;与Ⅱ组比较，△P<0.05，☆P<0.01

3 讨论

益赛普(Etanercept)即注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，是一种可抑制TNF-α功能的生物制剂。目前益赛普抗炎疗效的可能的机制包括：(1)减少炎症部位的细胞生成；(2)下调滑膜细胞因子的表达；(3)降低血浆MMP-1和MMP-3的水平；(4)可调节细胞的凋亡[4]。许多研究结果显示，应用益赛普治疗的RA患者关节炎症明显好转。TGF-β1和VEGF在血管新生的病理和生理中炎症具有重要作用。有研究认为TGF-β1诱导滑膜血管增生是通过刺激滑膜细胞分泌VEGF来实现的。RA滑膜组织中TGF-β1表达增多，调节FGF从而影响血管新生和滑膜细胞增殖。研究显示，在体内TNF-α启动VEGF生成以促进血管新生，抗TNF-α治疗可降低VEGF生成及与RA相关的血管新生，使增生血管复原[5，6]。抗TNF-α制剂，在体外培养的滑膜细胞可抑制VEGF生成[7]。本试验显示，益赛普可抑制滑膜组织TNF-α、TGF-β1和VEGF的过度表达。益赛普治疗组滑膜组织TNF-α的表达低于单纯造模组，而甲氨喋呤组与单纯造模组无统计学差异，说明益赛普可降低滑膜组织TNF-α的表达。益赛普治疗组滑膜组织TGF-β1、VEGF的表达均明显低于单纯造模组，高剂量组明显低于甲氨喋呤组，而低剂量组与甲氨喋呤组无统计学差异(P>0.05)。说明益赛普可以降低AA大鼠滑膜组织TGF-β1、VEGF的表达，抑制新生血管形成，从而减少血管翳的形成。益赛普治疗组大鼠滑膜组织病理积分均明显低于单纯造模组；高剂量组明显低于甲氨喋呤组，而低剂量组与甲氨喋呤组无统计学意义。说明益赛普可以有效抑制或延缓AA大鼠关节病理改变，减轻关节病变程度且成剂量依赖性。与甲氨喋呤治疗组比较，益赛普高剂量组在TNF-α、TGF-β1和VEGF在滑膜的表达、滑膜病理积分均明显降低，而低剂量组与甲氨喋呤组无统计学差异，说明益赛普起效早于甲氨喋呤，近期效果优于甲氨喋呤，这可能与给药方法不同，以及甲氨喋呤起效缓慢有关，但远期疗效尚有待观察。本试验说明：经益赛普治疗的AA大鼠，从滑膜TNF-α、TGF-β1和VEGF水平、滑膜病理积分几方面均显著低于未经治疗的AA大鼠，近期疗效优于甲氨喋呤，其机制可能与益赛普中和TNF-α，抑制了TNF-α促炎因子的作用，从而间接抑制了对血管翳形成直接造成软骨和骨破坏起主要作用的TGF-β1、VEGF的表达有关。益赛普作为一种新兴的生物制剂，对于传统的抗风湿药而言，尤其是对传统抗风湿药物禁忌、耐药和毒副作用较为严重的RA患者，可作为新一类的治疗药物以供临床选择。

图1 正常滑膜组织(×400)

图2 佐剂关节炎大鼠膝关节骨膜(HE) (×400)

图3 TNF-α在正常滑膜组织的表达(×400)

图4 TNF-α在佐剂关节炎大鼠膝关节滑膜的表达(×400)

图5 VEGF在正常滑膜组织的表达(×400)

图6 VEGF在佐剂关节炎大鼠膝关节滑膜的表达(×400)

图7 TGF-β1在正常滑膜组织的表达(×400)

图8 TGF-β1 在佐剂关节炎大鼠膝关节滑膜的表达(×400)

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Effect of rhu-TNFR-Fc on the expression of TNF-α,TGF-β1 and VEGF in synovium of rats with adjuvant arthritis

GUOLiXia,XUYuDong,WANGHao,etal.DepartmentofUrology,GeneralHospitalofNorthernChinaPetroleumAdministrationBureau,Hebei,Renqiu062552,China

ObjectiveTo investigate the effect of rhu-TNFR-Fc (etanercept) on the expression of TNF-α,TGF-β1 and VEGF in synovium of rats with adjuvant arthritis (AA).MethodsThe adult male Wistar rats were randomly divided into 5 groups: the rats in group Ⅱ～Ⅴ were injected with Freund complete adjuvant to induce the experimental animal models with AA,on the 12th day after induction,the rats in group Ⅲ were given MTX (2.7mg/kg.w) by gavage;the rats in groupⅣ and group Ⅴwere given etanercept by subcutaneous injection.After 28 days,the synovium of joint of rats was taken out to be HE stained,then synovium pathological score was calculated,and the expression levels of TNF-α,TGF-β1 and VEGF protein in synovium of knee joint were detected by histoimmunochemistry.ResultsThe expression levels of TNF-α,TGF-β1 and VEGF in group Ⅱ～Ⅴ were significantly higher than those in groupⅠ(P<0.05),The expression levels of TNF-α in group Ⅳ and group Ⅴ were obviously decreased,as compared with those in group Ⅱ (P<0.05),however,there were no significant differences between group Ⅲ and group Ⅱ (P>0.05).The expression levels of TGF-β1 and VEGF in rats' synovium tissues in group Ⅲ～Ⅴ were significantly lower than those in group Ⅱ(P<0.05).ConclusionEtanercept can obviously reduce the expression levels of TNF-α,TGF-β1 and VEGF in rats' synovium tissues,which has obvious therapeutic effect on joint inflammation of rats with AA.which may inhibit blood vessel neogenesis in local tissues.

adjuvant-induce-arthritis rat;rhu-TNFR-Fc;tumor necrosis factor-α;transforming growth factor-β1;vascular endothelial growth factor

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.07.002

062552 河北省任丘市，华北石油管理局总医院肾内科

R 593.22

A

1002-7386(2014)07-0969-003

2013-11-07)