徐廷滔,白忠义，龙朋朋，张 攀，于保东

(1.吉林大学植物科学学院，吉林 长春130062；2.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033)

申克氏孢子丝菌(Sporothrixschenckii)是双相型病原真菌，在自然条件下表现为菌丝相，而在体内和37℃为酵母相。申克氏孢子丝菌引起人和动物的皮肤、皮下组织及其附近淋巴系统的慢性感染，称之为孢子丝菌病(Sporotrichosis)[1]。该病常常与皮肤的轻微外伤后接触被病原菌污染的物质有关。临床上孢子丝菌病分为淋巴管型、固定型及播散型。其中最常见的是淋巴管型，引起皮肤渗出、化脓，甚至溃烂。其次是固定型，常引起面部皮疹，多见于儿童。虽然播散型孢子丝菌病发生率不高，但该病如不及时治疗，可引起死亡[2]。近年来，随着抗肿瘤药物、抗生素等的广泛应用，以及恶性血液病和艾滋病等免疫受损人群的不断扩大，播散型孢子丝菌病呈上升趋势，严重威胁人类健康[3]。

随着后基因组时代的到来，迫切需要了解大量未知基因的功能。农杆菌介导的T-DNA插入突变技术是通过反向遗传学研究基因功能的重要方法,在多种植物及真菌中已获得大量T-DNA插入突变体[4-6]。而T-DNA插入位点侧翼序列的克隆是鉴定突变基因的关键步骤。热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)由Liu和Whittier首先研究并报道[6]。TAIL-PCR以基因组DNA为模板，利用低退火温度的简并引物和高退火温度的特异性嵌套引物，通过低特异性PCR和高特异性PCR交替的三轮温度不对称循环，扩增获得特异性产物。由于TAIL-PCR具有操作简单、快速、特异性强、重复性好、成本较低等优点，成为克隆已知序列侧翼的常用方法。

目前，对申克氏孢子丝菌分子生物学研究刚刚起步，要深入了解其致病机制，需要对相关基因进行分离和分析。本研究以申克氏孢子丝菌T-DNA插入突变株为材料，利用TAIL-PCR方法分离突变菌株T-DNA插入位点侧翼序列，为进一步挖掘申克氏孢子丝菌的功能基因，在分子水平上探讨相关机制奠定基础。

1 材料

1.1 菌株

申克氏孢子丝菌(S.schenckii)野生型及T-DNA插入突变菌株Ss1-Ss5由吉林大学中日联谊医院提供。

1.2 引物

本研究所用引物见表1，其中T-DNA-R和T-DNA-F为扩增T-DNA(left border -trpC-hph-right border)引物；LB1，LB2，LB3为TAIL-PCR左边界嵌套引物；RB1，RB2，RB3为TAIL-PCR右边界嵌套引物；AD1，AD2，AD3，AD4为随机引物，上述引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

表1 本研究所用引物

2 方法

2.1 申克氏孢子丝菌基因组DNA的提取

将申克氏孢子丝菌野生型和突变菌株(Ssl-Ss5)接种于5 ml PDB(potato dextrose broth)培养基，于28℃，100 r/min振荡培养5 d。挑取培养的菌丝体，转移至1.5 ml离心管内，10 000 r/min 离心1 min，收集菌丝体，参照文献提供的方法提取孢子丝菌基因组DNA[8,9]。

2.2 T-DNA插入突变体的PCR 验证

利用提取的基因组DNA，以野生型申克氏孢子丝菌为阴性对照，PCR扩增突变菌株(Ssl-Ss5)的T-DNA。PCR反应程序为95℃,2 min后进入循环程序：94℃,30 s；53℃,30 s；72℃，1 min，共30个循环，最后，于72℃延伸10 min[10]。

2.3 TAIL-PCR分离突变体T-DNA侧翼序列

根据T-DNA插入载体pBHt1上的T-DNA序列设计左边界和右边界两套TAIL-PCR特异性嵌套引物LB1、LB2、LB3和RB1、RB2、RB3，同时设计四条随机简并引物AD1～AD4，TAIL-PCR扩增体系及扩增条件见表2和表3。TAIL-PCR是基于简并引物和特异引物的热不对称循环，分为三轮反应：第一轮PCR包括5次高特异性循环、1次低特异性循环、10次较低特异性循环和15次热不对称循环；第二轮PCR是以第一轮PCR反应产物稀释50倍作为模板，通过15次热不对称循环，使特异产物选择性放大，而非特异性的产物降到极低的浓度；第三轮PCR又将第二轮PCR反应产物稀释50倍作为模板，再通过30次热不对称循环，使特异产物进一步得到放大。通过三轮PCR反应即可获得T-DNA邻近的侧翼序列。TAIL-PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。TAIL-PCR产物回收后，以RB-3或LB-3作为引物，送北京英骏生物技术有限公司进行测序。

表2 TAIL-PCR反应体系的组成

3 结果

3.1 T-DNA插入突变株Ss1-Ss5分子鉴定

根据申克氏孢子丝菌突变菌株Ss1-Ss5中T-DNA(left border -trpC-hph- right border)左臂、右臂设计特异性引物T-DNA-F和T-DNA-R(两者之间片段大小为2 100 bp)，对突变菌株进行PCR鉴定。结果从这5株突变体中均扩增出一条大小约2 100 bp的条带，而野生菌株无特异性条带，表明T-DNA已整合到申克氏孢子丝菌Ss1-Ss5基因组中(见图1)。

表3 TAIL-PCR反应程序

*，**，***和****分别代表5，10，15和30个循环。

3.2 T-DNA插入突变株侧翼序列的分离

取TAIL-PCR的第二轮和第三轮PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，结果这五株突变体，在第二轮扩增时均获得2-3条PCR产物条带，特异性较差；经过第三轮扩增后，获得大小为300 bp左右的特异条带，且第三轮PCR产物比第二轮PCR产物小100 bp左右(见图2)。产物经凝胶回收试剂盒纯化后进行测序。序列分析表明，利用TAIL-PCR从五株突变株中均获得申克氏孢子丝菌T-DNA插入位点侧翼序列，且侧翼序列之间无同源性(见图3)。

4 讨论

T-DNA插入位点侧翼序列的克隆是分离功能基因的关键步骤。目前已建立了几种用于克隆T-DNA插入位点侧翼序列的方法，如接头连接介导PCR、反向PCR、质粒营救及TAIL-PCR等[11,12]。而由Whitter和Liu等首先研究并报道的TAIL-PCR是利用嵌套的特异引物和简并引物组合，以基

因组DNA作为模板，利用引物长度和特异性的差异设计不对称的温度循环，然后通过三轮反应来扩增特异性的目标产物，获得已知序列的侧翼序列[7]。

利用TAIL-PCR扩增侧翼序列与其它方法相比具有如下优点[13]:首先TAIL-PCR直接以基因组DNA为模板筛选目标序列，可快速获得目标片段。操作简单、快速，省去了酶切、连接、加尾等繁琐步骤。其次，TAIL-PCR技术不涉及连接反应，实验结果较稳定，重复性好，准确可靠。另外，接头连接介导PCR、反向PCR等方法均需要DNA连接酶、限制性内切酶及对引物进行特殊修饰，而TAIL-PCR只需特异引物和简并引物，降低实验成本。

本实验采用TAIL-PCR技术，从5株申克氏孢子丝菌突变体中克隆到T-DNA插入位点的侧翼序列，该实验结果表明TAIL-PCR是简单、快速、高效分离申克氏孢子丝菌T-DNA侧翼序列的有效方法，为深入挖掘申克氏孢子丝菌的功能基因，探讨双相型原真菌的分子机制奠定基础。

参考文献：

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