杨会林，董 晶

(北京大学深圳医院 检验科，广东 深圳518036)

据世界卫生组织(WHO)统计，全世界约有10%-15%的育龄夫妇患有不孕不育症，其中由男性因素导致的不育症约占30%-50%，同时30%以上的男性不育症患者是由于遗传学异常导致生精功能障碍引起[1]，在临床上主要表现为严重少精子症(精子密度<5×106/ml)和无精子症(精液离心后镜检未发现精子)。染色体异常是造成男性不育的重要遗传学因素，据统计，在男性不育患者中，染色体异常的发生率为2%-5%，在少精子症和无精子症中更高达15%[2]。Y染色体为男性特有，与男性特异的遗传学性状密切相关，Y染色体与男性不育的关系一直是男科学的研究重点，尤其是对Y染色体长臂(Yq11)上的无精子因子(azoospermia factors,AZF)区域缺失的研究。AZF分为4个区域，即AZFa区、AZFb区、AZFc区、AZFd区，AZF任何一个座位的缺失都可能导致生精功能障碍[3]。本研究对142例严重少精子症和178例无精子症患者进行细胞遗传学和Y染色体AZF微缺失分析，以便为患者明确诊断，对患者进行正确的生育指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂和主要仪器 外周血淋巴细胞培养基购自德国Cytogen公司；全血DNA提取及AZF检测试剂购自亚能生物技术(深圳)有限公司；PCR仪购自美国ABI公司；凝胶成像分析系统购自美国BioRad公司。

1.1.2 研究对象 142例严重少精子症和178例无精子症患者来自我院生殖中心及遗传咨询门诊。所有患者均按照WHO(2010)精液常规分析标准规定，连续3次精液分析，精子密度<5.0×106/ml的患者诊断为严重少精子症；精液离心沉淀镜检未见精子的患者诊断为无精子症，并选取100例精液参数正常男性作为AZF微缺失检测正常对照。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 无菌操作采集研究对象的肝素抗凝静脉血2-3 ml用于染色体检查，EDTA抗凝静脉血2-3 ml用于AZF微缺失检测。

1.2.2 外周血细胞培养染色体分析 无菌操作抽取0.4 ml肝素抗凝全血置于淋巴细胞培养基中，混匀后置5%CO2培养箱恒温37℃培养72 h，制备染色体标本，G显带。油镜下分析5个分裂相，计数30个分裂相。有嵌合核型时加计数至100个分裂相，必要时加做C显带、N显带进一步分析。根据ISCN2009人类细胞遗传学国际命名体制命名。

1.2.3 Y染色体AZF微缺失检测 使用深圳亚能生物技术有限公司Y染色体微缺失基因检测试剂盒，采用多重PCR方法对DNA进行AZF微缺失检测，检测位点包括AZFa区：SY82、SY84、SY86；AZFb区：SY124、SY127、SY128、SY133、SY134、SY143；AZFc区：SY239、SY242、SY254、SY255；AZFd区：SY145、SY152，共15个位点，每个PCR反应体系里均有Y染色体性别决定基因(SRY基因)做内控，并设置阳性对照(正常男性DNA)和阴性对照(超纯水)。……