肖灿军,谭 茵,熊白玉,李小文, 区栋财,丁浩强,叶 欣, 黄颖烽

(1.广州医科大学研究生院，广东 广州 510182;2.广州医科大学基础学院;3.广州血液中心;4.广州医科大学附属广州第一人民医院 普外科)

人类白细胞抗原(HLA)受控于人类主要组织相容性复合体(MHC)的基因簇，位于人类第6号染色体的短臂(6p21.31)，是迄今为止最具多态性的人类基因系统[1,2]。其化学本质为糖蛋白，由一条α重链(被糖基化的)和一条β轻链非共价结合而成,遗传特点呈现单倍体遗传，高度多态性，连锁不平衡特性。HLA与器官移植的排斥反应密切相关，同时在机体免疫细胞的发育、免疫识别和特异性免疫应答中起着关键作用。随着遗传免疫学、分子生物学的迅速发展，人类对HLA系统结构及功能的认识及阐明亦逐渐在完善，同时新的等位基因也不断地被发现。

本课题组在对结直肠癌患者人群进行常规HLA分型的过程中，发现一份标本的HLA-A位点出现基因突变，与世界通用HLA等位基因数据库已有序列不相符，对其进行HLA核苷酸测序，结果如下：

1 材料与方法

1.1研究对象标本来自于广东地区一例右半结肠癌伴卵巢转移女性患者的全血标本 。

1.2仪器与试剂全血基因组DNA快速提取试剂盒(美国Qiagen公司)、PCR扩增仪(美国Life Technologies公司)、凝胶成像系统(美国UVP公司)、PCR-SBT-HLA-A、-B、-C、DRB1基因分型试剂盒(德国Abbot公司、美国TBG公司)，3130XL全自动测序仪(美国ABI公司)、数据分析软件为Assign软件(澳大利亚 Conexio Genomics公司，3.5版)。

1.3方法

1.3.1 基因组DNA提取 患者血液样本于术前检查时抽取，取5%EDTA抗凝外周血3 ml， 以5%EDTA抗凝，低速离心(速度：1 000 r/min，时间：5 min)后取白膜层，按试剂盒操作说明书提取DNA(详细步骤按试剂盒操作说明书操作)，-20℃保存。

1.3.2 HLA基因分型检测：采用德国Abbot公司AlleSEQR Combikits PCR-SBT试剂盒(具体操作步骤按说明书)。

扩增反应体系：总反应体积为25 μl，见表1。

表1 扩增反应体系

反应条件为：95℃ 3 min →95 ℃ 15 s ，65 ℃ 30 s ，68 ℃ 5 min ，共35个循环→68 ℃，10 min→4 ℃。

测序反应体系：总反应体积为10 μl，见表2。

表2 测序反应体系

反应条件为：96℃ 10 s→96 ℃ 10 s，50℃ 10 s，60 ℃ 2 min ，共25个循环→4℃。序列分析使用澳大利亚Conexio公司Assign软件(3.5版)。

1.3.3 新基因确认试验：按照美国TBG公司PCR-SBT分型试剂盒说明书，对HLA-A位点第2、3外显子进行特异性扩增。对扩增后的产物测序，序列分析使用澳大利亚Conexio公司Assign软件(3.5版) 。

1.4基因提交核苷酸序列经GeneBank比对后，提交世界卫生组织HLA因子命名委员会申请确认并命名。

2 结果

2.1HLA基因分型结果在对结直肠癌患者DNA采用德国Abbot公司AlleSEQR Combikits SBT试剂盒进行HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB常规分型中，使用Assign软件分析，发现一HLA-A位点无完全匹配的结果，与其最接近的匹配结果A*33:03:01，其碱基位点491出现不完全匹配，提示有新基因序列出现。

2.2新基因确认试验用美国TBG公司PCR-SBT分型试剂盒测序试剂再次对A位点进行单链测序，发现在外显子3的碱基位置491出现T→A点突变，密码子位置149由GCT→GCA，两者编码的氨基酸相同，仍为丙氨酸，为同义突变(图1、图2)。新基因序列提交Genbank并申报WHO HLA因子命名为委员会，被正式命名为HLA-A*33:03:14。

HLA-A*33:03:14与HLA-HLA-A*33:03:01序列比对图，图中浅黄色纵向条带区域碱基位492由T→A。

图2 HLA-A*33:03:14与HLA-A*33:03:01的碱基序列及氨基酸对照图

3 讨论

HLA系统的遗传特点(复等位基因、共显性表达、单元型遗传、连锁不平衡)决定了其具有高度的多态性，因此同一HLA座位上可出现不同等位基因。DNA链碱基突变、缺失、插入，染色体重排、转换、倒位、重复及基因重组均可造成新等位基因的产生[3-4]。DNA序列分析(PCR-SBT)被认为是最理想的HLA分型及鉴定HLA新等位基因方法，广泛地应用于科研工作中[5]。本课题组在HLA多态性与胃肠道肿瘤遗传相关性的研究中,发现新的等位基因HLA-A*33:03:14与其高度同源的HLA-A*33:03:01主要区别在于外显子3位置492核苷酸由T→A，密码子位置149由GCG→GCA。相应编码的氨基酸不变，为同义突变。HLA-A*33:03:14在广东汉人中的发现丰富了HLA基因库，扩大了HLA基因系统的遗传多样性。

HLA-A属于经典的HLA-1类分子，其多态性主要表现在2、3外显子，A*33：03在中国汉族人群中比较常见，出现的概率约为8.1%，地域分布无差异性[6]。研究表明HLA的多态性与多种免疫性疾病及肿瘤具有相关性。目前，大量文献表明HLA-B27与强直性脊柱炎具有高度相关性，是其发病的易感基因，检测其相应抗原的表达对诊断强直性脊柱炎具有重要的临床意义[7-8]。HLA-C与甲状腺乳头状癌(PTC)的发生发展也具有相关性[9]。同时，HLA基因多态性还表现在种族性和地域性，Fronik等研究发现黑人狼疮性肾炎与等位基因DQB1*0602及DQB1*0502高度相关，亚洲人狼疮性肾炎则与DQB1*0502相关最为明显[10]。本文涉及HLA多态性与胃肠道肿瘤遗传相关性研究，HLA-A*33：03：14是此研究中于一例右半结肠癌伴卵巢转移患者全血中发现的新等位基因,遗憾的是我们未能够采集到患者家属的血液标本进行家族遗传流行病学分析。目前关于HLA多态性与胃肠道肿瘤相关性的文献报道甚少，HLA的多态性与胃肠道肿瘤是否有相关联性值得进一步探索和研究。肿瘤的发生是多因素的结果，环境因素和遗传因素是其主要的发病因素，但大量的流行病学研究表明暴露于相同环境的人群只有少数个体发病，体现遗传易感因素的重要地位。总而言之，HLA抗原作为人体细胞表面的重要标志之一，在免疫应答及免疫调节中具有重要的临床作用，并且与人体疾病的发生、发展有着密切的关系。目前尚未提出一种学说能完全阐述HLA与疾病的关联机制，但是目前的HLA与疾病相关性学说例如拟态学说、受体学说、免疫应答基因学说、连锁不平衡学说、共同表位学说都能不同程度的解释和说明一些问题，因此推断肿瘤的发生发展与HLA多态性密不可分。鉴于其相关性，通过探讨肿瘤的发生发展与HLA某些等位基因之间的关系，有望在基因水平推测肿瘤的发病机制或发现与某些肿瘤相关性较强的HLA标志物应用于临床。甚至有望做到早期发现某些在目前医疗水平下难以诊断的隐匿性肿瘤，提高治疗的效果，改善患者生存率及生活质量从而更好地服务于医学研究及临床诊疗。

作者简介：肖灿军(1988- )，男，在读研究生，普外专业;黄颖烽(1966-)， 男，教授，主任医师，硕士生导师， 主要从事胃肠道肿瘤及甲乳疾病的外科手术治疗。

参考文献：

[1]Shao MX,Nakanaga T,Nadel JA，et al.Cigarette smoke induces MUCA5AC mucin overproduction via tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme in human airway epithelial (NCI-H292) cells [J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2004，287(2):420.

[2]谭 茵，黄颖烽，徐秀章,等.MICA新等位基因MICA*002 ：04 的DNA 序列鉴定及分析[J].中国免疫学杂志,2011，27(5):434.

[3]刘孟黎，齐 珺，习杰英，等．DNA测序确认人类白细胞抗原新等位基因A*03；30及二例家系调查分析[J].中华检验医学杂志，2009，32(1):66.

[4]张春来，梁 刚，张 毅,等.基因测序鉴定新等位基因 HLA-A*11：01：37[J].中华血液学杂志，2012,33(9):756.

[5]黄 飞，肖露露，阎文瑛,等.PCI卜SSP/PCR—SBT—I玎LA高分辨等位基因分型比较[J].中山大学学报(医学科学版)，2006，27(38):21.

[6]李 杨，何 军，鲍晓晶,等.中国汉族人群供-受者HLA-A、B、C、DRB1和DQB1高分辨等位基因频率分布及错配比例的研究[J].中华遗传学杂志,2011，28(1):92.

[7]李梦远,姚中强,刘湘源.HLA-B27与强直性脊柱炎免疫学机制的研究进展[J].生理科学进展，2011，42(1):16.

[8]倪吴花,胡晓霞,章圣辉,等.强直性脊柱炎867例HLA—B27的表达及意义[J].实用医学杂志,2008,24(9):1511.

[9]Haghpanah V,Khalooghi K ,Adabi K.Associations between HLA-C alleles and papillary thyroid carcinoma[J].Cancer Biomark,2009，5:19.

[10]曹孟德，秦东春，孙含笑.HLA分子生物学及临床应用[M].郑州，河南医科大学出版社，2000：178.