李光燮，王 师，王 丹，李英顺，金清华*

(1.延边大学医学院 生理学与病理生理学教研部，吉林 延吉133002；2.延边大学临床学院)

海马是哺乳类动物完成学习记忆功能的关键结构[1]，海马的三个亚区及其相关神经网络在各种学习记忆中起着不同的作用[2]：①齿状回(DG)区在传入信息的编码中有重要作用；②CA3区在工作记忆和短时程记忆的巩固和再现中起关键作用；③CA1区对中时程记忆的巩固和再现很重要。文献报道，损毁大鼠海马DG区可导致学习记忆功能的损害[3，4]，提示海马DG区作为信息进入海马的传入点，对信息进行处理和编码，在学习记忆中起着至关重要的作用。研究表明，海马内氨基酸类物质的改变可影响学习记忆能力[5]，我们先前的研究也表明，海马DG区内的天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)和牛磺酸(Tau)的含量在回避性条件反射建立过程中明显增加[6]。

黄芪(Radix Astragali)系多年生草本植物，又叫北芪、绵芪等，为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，其成分主要有多糖、黄酮类和皂苷类等[7]。黄芪作为一味常用中药，始载于《神农本草经》，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌之功效。研究表明，黄芪还具有抗疲劳、抗病毒感染、调节血糖、抗脑缺血缺氧、抗氧化、增加机体免疫力、提高记忆力等诸多功效[8]。虽然黄芪因其抗氧化、抗脑缺血缺氧等作用在增强学习记忆能力的研究上备受关注，但是到目前为止，关于黄芪对海马区氨基酸类物质的释放是否有影响未见报道。因此，本实验利用穿梭箱观察大鼠学习记忆能力的基础上，主要利用脑部微量透析法和高效液相色谱法观察了黄芪水体液对海马DG区细胞外液中的氨基酸类物质含量的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性Wistar大鼠24只，体重为200±20 g，由延边大学医学部实验动物科提供。动物随机分成3个组，即对照组、黄芪小剂量组(1.5g/kg)、黄芪大剂量组(4.5g/kg)，每组各8只。

1.2 黄芪水提取物的制备及灌胃

长白山道地黄芪，4-5年生。先将药材浸泡24小时，然后煎煮3次，每次加入10倍黄芪量的水，每次煎煮120 min，将3次滤液混匀，浓缩制得浸膏，4℃冰箱储存备用。开始实验时，用生理盐水稀释浸膏，制备0.6 g/ml和1.8 g/ml的黄芪水体液，分别用在黄芪小剂量和大剂量组。采用无损伤灌胃针每次灌胃0.5 ml相应溶液(对照组用生理盐水)，每日1次，持续3周。

1.3 实验方法

1.3.1 手术及DG区微量透析过程 大鼠用10%的水合氯醛(300 mg/kg)进行腹腔麻醉，腹卧位固定于立体脑定位仪上，参照Paxinos和Watson大鼠脑图谱，将透析用外套管(内径 0.50 mm,外径0.70 mm)插入到DG上1 mm处(前囟向后3.4 mm,正中线旁开2.2 mm,深度 2.5 mm),并用牙托粉固定于颅骨表面。经透析用外套管将自制的微量透析探针垂直插入到DG区，并用蜡固定。探针超出套管1.0 mm，其前端有外径0.2 mm的乙酸纤维素半透膜(DM-22，Eicom,日本)，可滤过分子量小于50000的物质。微量透析探针连接于微量泵(ESP-64，日本Eicom公司),以1.5 μl/ min的速度灌流改良Ringer’s液(147 mM NaCl，4 mM KCl，2.3 mM CaCl2，pH 6.5),稳定60 min后,经自动收集器(EAS-20，Eicom，日本)收集微量透析样本,每管样本收集10 min,每只动物收集3个管,取平均值。样本收集结束后，拔出探针，外套管封好，大鼠回笼恢复。术后第二天开始灌胃，持续3 w。灌胃结束后，大鼠水合氯醛麻醉，经外套管将微量透析探针重新插入到DG区，收集海马DG区微量透析样本(方法同上)，然后进行穿梭箱训练。

1.3.2 微量透析样本中的6种氨基酸含量的测定 每管样本取12 μl和3 μl的OPA溶液在室温下反应2.5 min后,抽取10 μl注入到生物活性物质微量分析系统 (HTEC-300，日本Eicom公司),以0.5 μl/min的速度流过高效液相色谱分离柱和电化学检测器分析出氨基酸类物质的浓度,包括天冬氨酸(Aspartate,Asp)、谷氨酸(glutamate,Glu)、谷氨酰胺(glutamine,Gln)、甘氨酸(glycine,Gly)、牛磺酸(taurine,Tau) 和丙氨酸(Alanine,Ala)(图1)。

图1 海马DG区6种氨基酸的典型高效液相色谱图

1.3.3 行为学检测 穿梭箱是一长方体箱子，中间用一隔板分开，隔板底部中间有一个半圆型洞，使两个隔间相通，动物可通过此洞在两隔间自由穿梭。每天的穿梭训练过程如下：将大鼠置于其中一个间隔，适应3 min，先给5 s声音刺激，再给10 s电刺激(如果动物穿过洞口，达到另一隔间，就结束该次声音或电刺激)，间隔20 s，重复相同刺激，共20次。每天进行一次穿梭训练，连续训练5天。每天完成20次训练所需要的时间作为大鼠学习记忆能力的指标。

1.4 组织学鉴定

实验结束后，动物过量麻醉处死，取脑固定在10%的福尔马林溶液中，3天后进行冠状面的冰冻切片(厚度约60 μm)、中性红染色，光学显微镜下进行组织学鉴定，确定透析探针的位置是否在DG区。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 组织学鉴定

大鼠脑标本与Paxinos & Waston大鼠脑图谱进行对比，确认微量透析探针的位置(图2)，透析探针未进入海马DG区者不计入统计。

2.2 黄芪水提取液对大鼠海马DG区氨基酸类物质含量的影响

图2 标记微量析透析探针在DG区位置的典型显微组织图

大鼠在灌胃开始之前测定海马DG区细胞外液中的Asp、Glu、Gln、Gly、Tau和Ala含量，结果显示，每种氨基酸含量在各组之间没有显著性差异(均为P>0.05，表1，2)。对照组利用生理盐水灌胃3w，灌胃前后DG区细胞外液中的6种氨基酸含量没有显著的变化(均为P>0.05，表1，2)。黄芪小剂量组和黄芪大剂量组利用黄芪水提液灌胃3w，灌胃前后海马DG区细胞外液中的Asp、Glu、Gln、Gly和Ala的含量没有出现明显的变化(均为P>0.05，表1，2)。

黄芪小剂量组大鼠海马DG区细胞外液中Tau的含量，给药前为0.84±0.05 μmol/L，而灌胃后为0.99±0.06 μmol/L，两者有显著性差异(P<0.05，表1)。黄芪大剂量组海马DG区细胞外液中Tau的含量，灌胃前为0.80±0.08 μmol/L，而黄芪水提液灌胃后为0.98±0.09 μmol/L，灌胃前后比较有显著性差异(P<0.05，表1)。对照组大鼠生理盐水灌胃前后，海马DG区的Tau含量无明显变化(P>0.05，表1)。利用黄芪水提液灌胃3w后，大鼠DG区细胞外液中的Tau含量明显增加，和对照组相比有显著性差异(P<0.05，图3)。

表1 黄芪对大鼠海马DG区Asp、Glu、Gln含量的影响 (μmol/L)

表2 黄芪对大鼠海马DG区Gly、Tau、Ala含量的影响 (μmol/L)

*P<0.05，与灌胃前比较

图3 黄芪水提液对海马DG区细胞外液中的

以大鼠灌胃前的Tau含量作为100%，计算出灌胃后的Tau含量百分比。 #P<0.05，与对照组相比。

2.3 黄芪水提取液对大鼠学习记忆的影响

灌胃3w后，大鼠每天完成20次的穿梭训练,连续训练5天。对照组在整个训练期间，每天训练所需时间无明显变化(P>0.05)；黄芪小、大剂量组的每天训练所需时间逐渐缩短，到第四、第五天，训练所需时间与第一天比较有显著性差异(均为P<0.05)，与同一天的对照组相比，也有显著性差异(均为PP<0.05)(图4)。

3 讨论

黄芪是一味常用中药，其成分主要有多糖、黄酮类和皂苷类等，而且还含有硒、锌、铁等14种微量元素[7]。研究表明，黄芪可通过抑制钠泵活性、减少能量代谢障碍、清除氧自由基等途径促进脑血管再生、减少脑细胞凋亡，进而改善脑缺血缺氧损伤后的学习记忆能力[9]。本实验结果也显示，用黄芪水提液灌胃的大鼠在穿梭训练过程中出现训练所需时间的明显缩短，提示黄芪可以提高其回避反应的学习记忆能力。虽然这些都提示黄芪可提高学习记忆能力，但黄芪对海马区氨基酸类物质的影响报道较少。因此，本实验观察了黄芪对海马DG区氨基酸类物质含量的影响。

图4 黄芪水提液对穿梭训练中的每天训练所需

学习和记忆属于脑的高级功能，学习指人或动物从外界环境获取新信息的过程，记忆是指大脑将获得的信息进行编码、贮存和提取的过程，二者密不可分。众所周知，海马是哺乳类动物学习记忆的关键结构，研究表明，海马内的氨基酸类物质参与学习记忆功能[5]，而且脑缺血常伴有氨基酸类物质的增加[10]。海马DG区在新信息的处理和编码中起着至关重要的作用[2]，而我们先前的研究证明，在大鼠回避反应学习过程中伴有海马DG区内氨基酸类物质的增加[6]。为了进一步探讨黄芪对学习记忆的改善作用是否与海马内的氨基酸类物质有关，本实验利用脑部微量透析法和高效液相色谱法测定了海马DG区细胞外液中的Asp、Glu、Gln、Gly、Tau和Ala的含量。结果发现，黄芪可明显增加大鼠海马DG区Tau含量。

Tau是一种结构简单的β-氨基酸，在中枢神经系统中主要分布在大脑皮质、海马、小脑等区域，可能作为神经递质或调质起作用。文献报道，Tau可促进神经系统的生长发育、增强学习记忆能力、对缺血和惊厥等引起的神经元损害具有对抗作用，而且Tau与Glu关系密切，在大脑中二者水平呈高度正相关，Tau可通过抑制Glu的活性来减轻Glu的神经毒性作用[11，12]。另外，Tau能增加海马和皮层内Fos蛋白、B-EP，AVP的含量，这与学习记忆能力的调节有关[13]。因此，我们推测黄芪改善大鼠的学习记忆能力，可能与海马DG区Tau含量增加有关，但其下游的机制有待于进一步深入研究。

作者简介：李光燮(1973-)，男， 博士研究生，研究方向为神经生理学。金清华(1971-)，女，博士学位，教授，博士生导师, 研究方向为神经生理学。

参考文献：

[1]L Squire.Memory and the hippocampus:A synthesis from findings with rats,monkeys,and humans[J].Psychological Review,1999,2:195.

[2]RP Kesner,I Lee,P Gilbert.A behavioral assessment of hippocampal function based on a subregional analysis[J].Rev Neurosci,2004,15:333.

[3]H Jeltsch,F Bertrand,C Lazarus,et al.Cognitive performances and locomotor activity following dentate granule cell damage in rats:role of lesion extent and type of memory tested[J].Neurobiol Learn Mem,2001,76:81.

[4]GF Xavier,FJB.Oliveira-Filho,AMG.Santos.Dentate gyrus-selective colchicine lesion and disruption of performance in spatial tasks:difficulties in “place strategy” because of a lack of flexibility in the use of environmental cues[J].Hippocampus,1999,9:668.

[5]李永生，阎学案.中枢神经递质与学习记忆的相关性研究进展[J].实用医药杂志，2006，23(7):864.

[6]刘巧凤，金清华，姜海英，等.习得性长时程增强中清醒大鼠海马齿状回几种氨基酸的变化[J]．中国临床康复，2006，10(38)：71.

[7]LW Qi,QT Yu,P Li,et al.Quality evaluation of Radix Astragali through asimultaneous determination of six major active is of lavonoids and four main saponins by high-performance liquid chromatography coupled with diode array and evaporative light scattering detectors[J].Journal of Chromatography,2006,1134:162.

[8]马宏秀,张治祥.黄芪的药理研究进展[J].陕西中医学院学报,2004,5(27):73.

[9]蒋 犁，贾瑞酷，乔立兴，等.黄芪对新生鼠乏氧缺血脑损伤后海马区神经的保护及学习记忆能力的干预[J].中国临床康复，2006，10(7)：154.

[10]C Kohlhauser,S Kaehler,W Mosgoeller,et al.Histological changes and neurotransmitter leveles three months following perinatal asphyxia in the rat[J].Life Sci,1999,64:2109.

[11]A Shuaib.The role of taurine in cerebral ischemia：studies in transient forebrain ischemia and embolic focal ischemia in rodents[J].Adv Exp Med Biol，2003，526：421．

[12]张文革，王 勇，仲崇斌.牛磺酸对学习记忆影响的研究进展[J].生物学杂志，2004，21(1)：3.

[13]魏林郁，王宝英，李 炳．牛磺酸对睡眠剥夺大鼠学习记忆的影响[J]．现代医药卫生，2008，24(19)：2866.