封文静，管庆霞，张 亮，李梦雪，李永吉

(黑龙江中医药大学，哈尔滨150040)

丁香苦苷[1](Syringopicroside，SYR)是从丁香叶(Folium syringae)中分离后得到的单体成分，属于环烯醚萜苷类化合物，其具有很强的抗菌、抗病毒、保肝利胆等作用，尤其对乙型肝炎病毒作用显著.但由于其在体内消除较快，半衰期较短等原因，导致其生物利用度并不高.因此本研究采用复乳化法制得SYR－PLGA纳米粒，在此基础上选取既不需要离心将载药纳米粒与释放介质分离，又能保证纳米粒无损失的透析法进行SYR－NP的体外释放研究.

1 试剂与仪器

1.1 药品与试剂

丁香苦苷对照品 (黑龙江中医药大学药剂教研室自制，质量分数≥98%);丁香苦苷原料药(黑龙江中医药大学药剂教研室自制，质量分数≥95%);透析袋(MW:8 000－10 000，美国 Sigma公司);碳酸氢钠(批号111009，北京化学试剂公司);EDTA(批号20100715，天津市化学试剂厂);其他试剂均为分析纯.

1.2 仪器与设备

美国Waters公司高效液相色谱仪系统:2996Photodiode Array Detector，2695Separations Module，Empower色谱工作站;恒温水浴振荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司);PHS－3C型酸度计(金坛市荣华仪器制造有限公司);AB265－S电子分析天平(德国梅特勒公司).

2 实验方法与结果

2.1 SYR－PLGA纳米粒的制备

取PLGA(LA∶GA=50∶50)加入到二氯甲烷和乙酸乙酯1∶3的混合溶液中，制得质量浓度为20 mg/mL的 PLGA溶液，然后将丁香苦苷溶于蒸馏水中，制得10 mg/mL的药物溶液;其次，按照1∶4的体积比将药物加入到PLGA溶液中，超声乳化，制得初乳，然后，将该初乳注入体积分数为0.5%的poloxamer188水溶液形成初级复乳，然后将初级复乳按照10倍量体积加入到0.1%poloxamer188的水溶液中，以800 r/min磁力搅拌1～2 h后，将二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液减压旋转45～60 min挥发，形成胶体溶液，经过冷冻干燥后，形成SYR－PLGA纳米粒.

2.2 丁香苦苷纳米粒释放条件的研究

2.2.1 透析袋的处理

先将透析袋剪成适当长度的小段，在大体积的2%(w/V)碳酸氢钠和1 mmol/L EDTA中(pH=8.0)中将透析袋煮沸15 min，用重蒸水彻底清洗透析袋.再放在1 mmol/L EDTA中(pH=8.0)将之煮沸15 min，冷却后，用重蒸水彻底冲洗.将透析袋放在重蒸水中.存放于4℃保存备用，必须确保透析袋始终浸没在溶液内，取用透析袋时必须戴手套，以免造成污染.使用前在透析袋内装满水然后排出，反复冲洗，确保透析袋的清洁.

2.2.2 释放介质的选择

为了模拟体内条件，充分考虑血液环境的pH值在7.35～7.45之间 纳米粒进入血液循环中，血液环境pH值对其的影响，以及磷酸根离子大量存在于体内环境中可能对PLGA的降解产生的影响.本实验选取磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4)作为释放介质，采用透析法对SYR纳米粒进行释药研究.

PBS的配制:称取8 g氯化钠、0.2 g氢氧化钠、0.2 g无水磷酸二氢钾、0.9 g无水磷酸氢二钾，用重蒸水溶解后定容至1 000 mL.

2.2.3 释放介质稳定性考察

称取适量的丁香苦苷样品溶于50 mL pH值为7.4磷酸盐缓冲液中，置于溶出瓶中，37℃水浴，100 r/min恒速振摇，定时取样，测定其在0～96 h间的峰面积变化，其 RSD为1.41%(n=3)，表明丁香苦苷在pH值为7.4的磷酸盐缓冲液释放介质中的稳定性符合要求.

2.3 丁香苦苷纳米粒体外释放实验

2.3.1 体外释放分析方法的建立

1)色谱条件

色谱柱:ODS －C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);检测波长:221 nm;流动相:(甲醇∶水)=(50∶50，V/V);流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;进样量:10 μL.配制对照品溶液、样品溶液，进样测定.样品溶液SYR－PLGA保留时间与对照品溶液中的一致，辅料对主药测定无干扰(见图1).

图1 样品高效液相色谱图

2)标准曲线的绘制

精密称取干燥至恒重丁香苦苷对照品6.12 mg，置100 mL量瓶中，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至刻度，摇匀得质量浓度为0.061 2 mg/mL对照品溶液.分别吸取对照品溶液 0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 至10 mL 的量瓶中，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至刻度，分别取10 μL进样分析，以峰面积Y对质量浓度X进行回归，得到回归方程为Y=0.158 7X+0.769 6(r=0.999 7)，结果表明丁香苦苷在(1.224～24.448)μg/mL范围内线性关系良好.

2.3.2 体外释放实验

本实验采用动态透析法:一定量丁香苦苷纳米粒的冻干粉于适量的重蒸水中溶解，形成复溶液，分别精密吸取复溶液和SYR对照品溶液(均含主药3 mg).转入经处理后的透析袋中，扎紧透析袋两端，悬浮于50 mL具塞锥形瓶中，锥形瓶中加入磷酸盐缓冲液作为释放介质，将其置于恒温振荡器中，以温度37℃、转速100 r/min持续振荡，于不同的时间 5、10、30、45、60、120、240、360、480、600、720、1 080、1 040、1 800、2 160 min 吸取 2 mL 透析外液，并及时补充等量同温的新鲜的释放介质，用HPLC测定释放介质中丁香苦苷的含量，记录峰面积，计算各时间点SYR－NP冻干粉和SYR溶液的累积释放率，并以累积释药百分率(Q)对时间(t)作图，绘制载药纳米粒释放曲线.SYR－NP和SYR单体的体外释放数据见表1，释药曲线见图2.

在各时间点的累积释放百分率(Q)计算公式为:

其中:W为药物完全释放量;V0为初始体积;Vt为各时间点对应的体积;Ci为初始质量浓度;Ct为各时间点对应的质量浓度.

从表1和图2的结果可知，游离药物在4 h时体外累积释放量达到81.49%，而SYR－NP前4 h时释药较快，30 min时累积释放百分率达16.03%，4 h时仅释放了48.03%，之后释药曲线渐趋平稳，释放缓慢，在36 h时累积释放量达到88.03%，具有一定的缓释作用.

2.4 释药机制探讨

载药纳米粒的药物释放可以通过若干途径实现，主要取决于药物在粒子中所处的部位和载体的性质.如纳米粒表面降解释药、整体崩解、骨架扩散、水合膨胀、解离扩散和解吸附等途径.药物既有包封在粒子内部的，也有吸附在粒子表面的，还有在粒子浅表层或壳层内，因此不同部位的释药速度也不同.

目前解释缓控释制剂的释药动力学方程主要是以Fick’s扩散定律为基础理论而提出的，他们是以一些边界条件和假设为基础，从而得到的Fick’s扩散定律的近似解释，一般有下列常用模型[2].

若药物释放符合零级动力学模型，则方程为:

若药物释放符合一级动力学模型，则方程为:

表1 SYR－NP和SYR累积释放量的测定结果

图2 SYR－NP和SYR溶液的累积释药量曲线

处于粒子浅表层或深层部位的药物释放受扩散控制符合Higuchi方程为其中:Q为累积释药量，t为取样时间，a1－a3为常数，b1－b3为释药常数.

分别以零级动力学方程、一级动力学方程、Higuchi方程三种释药模型对SYR－PLGA进行体外释放的的拟合，结果见表2.

表2 SYR－NPS体外释放的拟合方程

SYR－NP的体外释放规律基本符合Higuchi方程的释药模型，拟合的释药动力学方程为:Q=0.128 1+0.018 9t1/2(r=0.956 8).

3 讨论

3.1 透析方法的筛选

本实验采用动态透析法[3]考察了丁香苦苷PLGA纳米粒的释药特性，其基本原理是将载药纳米粒混悬于一定的释放介质中，将透析袋与释放介质分开，透析袋是一种具有分子截留作用的半透膜药物经透析膜扩散至介质中，通过测定介质中药物质量浓度，获得累计释放规律的一种方法.该法操作简单，不破坏释药平衡，药物在释放介质中稳定性，溶解性好，不需要定时完全更换释放介质.本实验选取透析袋截留分子质量为8 000～12 000，即分子质量小于8 000～12 000的游离药物可以透过透析袋进入释放介质中，而被PLGA包封的药物因为分子质量大而被截留在透析袋里，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液为溶出介质，可满足漏槽条件.

3.2 释放机理的探讨

药物从PLGA纳米粒中释放机理有可能有以下几个方面:1)表面降解吸附;2)聚合物表面或整体溶蚀释放;3)通过纳米粒孔隙扩散;4)通过水溶性聚合物的扩散等.不同的释药机理主要取决于乳酸/羟基乙酸共聚物的分子质量、纳米粒的粒径大小、药物含量以及制备工艺等参数的不同.将丁香苦苷纳米粒冻干粉与游离丁香苦苷溶液进行对比释放实验，绘制释放曲线，可以清楚观察到药物从丁香苦苷纳米粒的释放分为突释和缓释部分[4].释放曲线可观察到初期的药物突释现象，随后释药曲线趋于平稳.前期释药较快，在最初的0.5 h释放了药物的16.30%.药物的突释量是药物溶解度的一个重要函数，溶解度越大，载药的纳米粒突释时释药速度越快，突释时间越长;溶解度越小，则突释量越少，突释持续时间越短[5].尽管纳米粒在体外释药情况与体内存在差别，但体外释药仍可以在一定程度上反映体内释药情况，为预测SYR－PLGA纳米粒的体内释药情况提供参照，并以此指导处方设计以及制备工艺的优化.

[1]王艳宏，李永吉，王艳芝，等.紫丁香叶中丁香苦苷的RPHPLC法测定[J].中草药，2003，34(3):268－269.

[2]SCHWARZ C，MEHNERT W.Solid lipid nanopartics(SLN)for controlled drug delivery Drug incorporatin.and physicochemical characterization [J].Journal of microencapsulation，1999，16(2):205－213.

[3]尹华峰，谭群友，陈学梁，等.溴吡斯的明磷脂复合物纳米粒的体外释放行为评价[J].中国医院药学杂志，2012，32(7):501－504.

[4]NIHANT N，GRANDFILS C，JEROME R，et al.Microencapsulation by coacervation of poly(lactide－co－glycolide)IV.Effect of the processing parameters on coacervation and encapsulation[J].Journal of Controlled Release，1995，35(2 － 3):117－125.

[5]王恺源，高永良.影响PLGA微球突释的因素以及控制技术[J].中国新药杂志，2011，20(6):557－562.