刘金涛

(呼和浩特市第二医院检验科，内蒙古呼和浩特010031)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是已知感染人类最小的DNA病毒。HBV感染不仅可以引起急性乙型病毒性肝炎(acute hepatitis B，AHB)、慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)，还与肝硬化(liver cirrhosis，LC)、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发生、发展密切相关。近年随着对HBV外膜大蛋白(large surface protein，LP)在HBV感染、复制及用于制备重组疫苗［1-2］、药物［3］等方面的探究，使其作为新的、更有价值的、可靠的乙型肝炎抗病毒治疗(antiviral treatment for hepatitis B，ATHB)监测的血清免疫学指标之一，受到临床广泛关注。

一、HBV-LP是唯一一种具双重拓扑结构、致肝细胞毒性、能反式激活增强病毒复制作用的外膜蛋白

1.HBV-LP独特双重拓扑结构是其发挥多种功能作用依赖性结构 HBV的3个外膜蛋白是从一个ORF的3个不同起始位点与相同终止位点翻译表达而来。HBV外膜蛋白不仅能组装成病毒包膜，还能组装成不含有核酸的小球形颗粒和亚病毒管状颗粒(subviral particles，SVPs)。HBV感染人体后在血清中以此3种病毒颗粒不同比例存在。在肝内病毒非复制期HBV-LP在血清中很低或无，大量滞留在肝细胞中。在病毒粒子成熟过程中HBV-LPPreS结构域停留在内质网(endoplasmic reticulum，ER)胞质面，通过S结构Ⅱ型信号和疏水C端跨过ER膜，约50%HBVLP跨膜区域的拓扑结构在翻译后发生改变，使PreS区域暴露于病毒粒子表面，从而产生HBVLP独特立体构象双重拓扑结构。

2.HBV-LP是致肝细胞损伤、死亡和纤维化病变主因 HBV-LP存在于Dane颗粒和SVPs上，是病毒形成完整外膜重要标志，与病毒复制、病毒颗粒组装和从细胞内释放调节密切相关。可根据HBV-LP有无来判断HBV携带者体内的HBV是否在进行复制。HBV-LP转录激活功能是由PreS2区域细胞质定位所产生的，可能使HBV携带者患HCC的可能性增大。目前认为HCC发展是由体内HBV-LP连续过表达造成的，过量HBV-LP在肝细胞ER积聚是导致ER应急的关键因素［4］，并导致肝细胞毒性甚至致癌。在对肝细胞有直接毒性作用的HBV表达抗原中只有HBV-LP有直接肝细胞毒性。毛玻璃样变是感染HBV晚期非复制状态肝细胞典型形态学特征，PreS1和PreS2区突变导致乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)在ER滞留并诱导ER应激。HBV-LP的过表达导致一些控制细胞增殖的激酶［蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、c-Raf-1激酶］的活化，这些酶的连续活化可能与HCC的发生有一定的相关性。据癌症发生机制多因子模型，HBV-LP连续表达也可能具肿瘤促发功能。有研究表明，HBV-LP通过触发PKCα/RAF1 SRC/PI3K/AKT信号通路促进肝癌细胞发生，这是揭示HBV相关HCC发病机制的新见解［5］。

3.HBV-LP的多功能性 由病毒编码的蛋白和蛋白结构域都具多种功能，HBV-LP亦是。HBV感染通常导致超过104倍病毒粒子SVPs的合成。SVPs包含宿主细胞来源的脂质和病毒衣壳蛋白，不具有核衣壳和核酸。HBV的衣壳HBV-LP在病毒生活周期中具有一系列不同的功能，可致病毒复制激活［6］。感染早期与细胞受体结合介导病毒粒子的细胞内摄入;感染晚期其对于病毒粒子的组装和分泌十分重要。HBV-LP的PreS1区和PreS2区有一个与翻译不同步的转位过程，在横跨ER膜时指向ER的胞质侧，HBV-LP上的PreS2区段在翻译后初期定位于ER的胞质侧，能够激活多种启动子元件，具同样转录激活功能。HBV-LP在病毒进入肝细胞时作为受体蛋白起作用，在病毒组装时则是基质类似蛋白，同时还行使调节功能，这种多功能性依赖于 HBV-LP PreS区独特的双重拓扑结构。有学者通过鸭肝模型研究发现，含有嗜肝病毒血清的感染性大小依赖于具有感染性的Dane颗粒的多少，还依赖于缺乏核酸、富含HBV-LP的亚病毒颗粒的数量，后者主要包括管状颗粒和小球形颗粒，这些颗粒有反式激活作用，能显著增强细胞内的病毒复制和基因表达［7］。有研究表明HBV-LP超量表达会通过反式调控作用使SVPs不会分泌，形成亚病毒包膜纤维体，其在细胞内积累可导致肝细胞液泡化和细胞凋亡。

二、HBV-LP检测的临床应用价值

1.HBV-LP是从蛋白水平进行患者机体内病毒复制监测及疗效判断的良好指标之一 HBVLP检测对隐匿性HBV感染具重要价值［8］，有研究表明HBV-LP的敏感性和特异性分别为64.89%和99.68%，HBV DNA的敏感性和特异性分别为60.63%和 100.00%(P＜0.05)［9］。HBV-LP作为判断HBV复制水平指标，并参与对肝细胞的损伤［10］。HBV-LP PreS区具有的较复杂的拓扑结构致PreS1检出率较低，不能很好地反映HBV复制情况。对乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)阴性患者HBV复制的评估是临床亟需解决的课题之一，HBV-LP对于判断HBeAg阴性患者体内复制具重要临床意义，是反映HBeAg阴性和低水平HBV DNA患者体内病毒复制、疾病进程、疗效与预后判断的敏感指标。由于持续免疫压力、长期治疗，HBV preC基因1896位发生G→A点突变，产生了一个新终止密码子(TAG)，阻断了HBeAg形成致临床发生HBeAg阴性，HBV DNA下降趋于转阴，难以依据HBeAg确定治疗时机［11］。新近研究也表明 HBV-LP与HBV 感染、复制及预后密切相关［12］，较 PreS1、PreS2、HBV DNA、HBeAg 敏感［13］。我国 10% 人群携带 HBV，其中10%～20%可发展为LC，HBeAg阴性CHB患者在不断增加，我国CHB患者尤其是LC患者中HBeAg阴性者高达60%以上［14］，探索简单、低廉判定HBV复制血清学指标成为研究热点之一。HBV-LP与HBV DNA在HBeAg阴性者中具较大差异［15］，HBV-LP与HBV DNA对乙型肝炎诊治及预后评估有互补作用［16］。对于抗HBe患者，因HBV DNA量与CHB肝脏炎症程度无关，定期开展联检，结合肝功能等进行综合评判肝损情况是进行科学合理治疗的根本。HBV-LP、HBV DNA及HBV血清标志物联检有助于疾病诊断、疗效观察及预后判断［17］。有研究表明HBV-LP与突变患者和非突变的患者HBV DNA水平呈正相关［18］，表明患者体内HBVLP与病毒复制程度密切相关，而且不受 HBV YMDD变异的影响。

2.HBV-LP有望成为新的更有价值的ATHB监测指标 目前ATHB只能抑制共价闭合环状DNA(cccDNA)再复制，并不能抑制已经形成的病毒表达蛋白，富含HBV-LP亚病毒颗粒在一段时间内仍存在。动态监测HBV-LP可作为病毒复制和疗效判定的重要指标［20-21］。临床针对HBV感染、复制、疗效观察和预后判断等血清学指标很多，但均具一定局限性。HBV DNA拷贝数和HBV-LP水平具良好相关性［19］。因HBV基因变异频繁，HBV-LP可弥补由 HBV变异引起的HBeAg检测不足［22］，在一定程度上反映了乙型肝炎患者肝功能状况［23］。HBeAg转阴、抗 HBe阳性患者仍存在病毒复制，对于HBeAg阴性CHB患者，HBV-LP检测反映病毒复制优于 HBV DNA，HBV-LP有指导治疗、判断预后的作用［24］，二者具互补作用，甚至在基层可替代HBV DNA测定［25］。HBV-LP利于对CHB预后监测，防止或延缓LC或HCC的发生、发展，是监测HBeAg阴性HBV感染者病毒复制、病情进程，判断疗效、预后及ATHB效果的敏感指标，可提高乙型肝炎患者血清学诊断水平［26］。HBV-LP尚不能完全代替HBV DNA的检测来反映HBV复制情况，但可作为HBV DNA的有效补充和加强［27-28］。HBV血清标志物模式多样且复杂，HBV-LP在HBV感染、复制和刺激机体免疫应答方面均起重要作用。HBV血清标志物与HBV DNA的复制表达差别较大，HBV血清标志物阳性者无论何种组合模式均存在病毒复制的可能，HBV-LP是HBV血清标志物较好的补充［29］。不同肝病病种中HBV-LP有差异性［30］。由于机体对HBV免疫应答是造成肝组织破坏和肝功能损害的主要机制，不能完全以HBV DNA来判断患者肝功能好坏。在条件有限的实验室，尤其是HBeAg阳性患者如不具HBV DNA检测条件可通过PreS1和抗HBV核心抗体IgM(HBcIgM)判定HBV复制及肝损。HBV-LP反映HBV复制对ATHB更具重要价值，是ATHB中的CHB患者的病程、疗效与预后判断的重要指标［31］。拉米夫定对CHB HBV DNA的残留阳性也意味着肝细胞内残留病毒的高复制能力。拉米夫定虽能明显降低HBV DNA水平，使丙氨酸氨基转移酶恢复正常，但治疗停药时间很难把握，即使部分病例按临床应用指导意见停药，仍出现病毒复发。随着ATHB手段的不断发展，原有监测指标已不能满足医患双方对CHB治疗结果评估的需要，HBV DNA阴转、HBeAg阴转不表示病毒停止复制［32］，有部分患者慢慢发展成为LC或HCC。ATHB中动态检测HBV-LP可用于评估抗病毒疗效［14，20］，不论其检测方法还是临床应用都具其独特优越性。但HBV-LP是否能够作为HBeAg阴性ATHB终点的有效判定指标，尚待进一步探讨［33］。有研究表明HBeAg阴性患者血清HBV-LP水平(≥3.889 mg/mL)在基线水平不应该被建议接受阿德福韦酯治疗［34］。

3.对HBV-LP高含量母亲的新生儿采取更有效措施是密切需要解决的问题 正确评估HBV宫内感染率将有助重新认识HBV宫内感染问题的严重性，HBV携带者孕妇不同HBV-LP可反映其传染性强弱，进而估计HBsAg阳性孕妇胎儿发生宫内感染危险性的高低［35］。携带HBV的孕妇尤其是HBsAg和HBeAg阳性孕妇，其子代感染风险约为88%～90%。我国每年约150万HBV携带者分娩，约80万儿童可能通过母婴垂直传播被感染。如不加预防，这些子代几乎全部将在出生后1年内成为HBsAg阳性HBV携带者。婴幼儿期感染建立了免疫耐受，感染者往往成为慢性甚至终身HBV携带者，易致LC甚或HCC。新生儿使用联合免疫后，母亲HBV-LP量仍影响着新生儿免疫效果。HBV宫内感染已成为乙型肝炎高发区严峻的公共卫生问题［36］。

4.HBV-LP可广泛应用于公共体检领域HBV-LP作为判断肝内病毒继续复制或复制活跃程度的指标，在出国劳务人员健康体检中具有较高的应用价值，有助于体检单位评价体检者的健康状态［37-38］。

三、HBV-LP研究进展

1.检测技术的进展 20世纪80年代HBVLP PreS与HBV复制关系已引起广泛关注，其意义得到公认。但检测手段缺乏，应用不广。20世纪90年代从蛋白组成上认为PreS1是HBV-LP所独有，其作为新标志一直是HBV检测领域研究热点，PreS区研究是将PreS1和PreS2作为独立单元进行的。90年代中期，我国已有PreS商品化定性试剂，仅能检测到微弱抗PreS1产生。90年代末，军事医学科学院马贤凯等使用基因重组PreS制备多抗组装成试剂盒，在HBsAg、HBeAg、抗HBc均阳性及HBsAg、抗HBe、抗 HBc均阳性中检出率无显著差异，与HBV复制的相关性也不够高。由于HBV-LP表达具有很强的细胞内滞留性，HBV-LP PreS难以体外重组表达，同时该HBV-LP极容易降解，将HBV-LP PreS区作为一个整体对其蛋白功能研究相对较少。国内近期才有完整表达PreS区抗原的成功［39］。国外对于S区抗原检测研究始于1984年，Klaus等用HBV感染者的血清分离出HBV颗粒，分离出一株PreS1区线性表位aa31-33区段的单抗，但未在临床诊断中应用。90年代至今，针对PreS区蛋白整体性构象型蛋白研究日益受到重视。有研究证明HBV-LPPreS区具HBsAg众多免疫表位，由HBVLP组装成的亚病毒颗粒能够反式激活病毒继续复制，有相关乙型肝炎鸭模型证实，这对临床具实际意义。临床上一定比例［HBsAg、抗 HBe、抗HBc均阳性］患者ATHB后(HBV DNA低拷贝数)存在亚病毒颗粒［PreS(阳性)］。对HBV外膜蛋白深入研究发现HBV-LP在完整病毒外壳组装过程中起着决定性作用。整个PreS区都暴露在病毒颗粒的表面，HBV-LP在穿越ER时需要形成双重拓扑结构，HBV-LP折叠使PreS区形成一个结构型依赖的区域。表位构成方式至少有2种:线性表位和构象表位。病毒抗原的免疫检测研究中，大多都采用病毒的部分基因重组抗原或合成多肽制作的单抗。近年逐渐认识到合成多肽一般只具线性表位，而不具抗体所识别的构象型表位。当病毒优势抗原表位是具有立体空间构象型的抗原表位时，采用基因重组或合成肽的抗原制作的单抗其检测病毒抗原的敏感性必定受到影响，最好的办法是采用病毒样颗粒上天然抗原决定簇或能模拟其结构的重组蛋白来制作出针对其构象型表位的单克隆抗体。针对HBV-LP拓扑结构特异性单抗是检测HBV-LP的较好选择。近年通过蛋白修饰等技术已可在体外完整表达并纯化出HBV-LP，从而使HBV-LP相关功能研究成为可能。

2.最新研究成果 HBV感染与HCC高度相关。Dorobantu等［40］报道胆固醇在维持 HBV-LP独特的双重拓扑结构上是非常重要的，这是病毒外膜的关键。而α-酸性葡萄糖苷酶代谢异常是恶性转化的标志［41］，这些研究表明了HBV-LP受脂类、碳水化合物代谢的影响。HBV-LP PreS突变被认为是HBV相关肝细胞癌变的关键。研究结果强烈表明，HBV与C53的结合是一个新的负调节点反应，这可能是引起HCC的HBV潜在的新机制［42］。Mun 等［43］揭示 F141L 在HBV-LP 诱导细胞增殖和转化中起重要作用，F141L突变可作为HCC诊断标志物。以往的研究表明HBV PreS2变异是一个重要的发展成HCC的风险，但其与化疗药物治疗间的关系仍不清楚，Hung等［44］的结果提示，HBV PreS2在增加 Bcl-2的表达中起着重要作用，这提供了一个重要的HBV PreS2相关肿瘤化疗策略。为了阻止病毒进入，几个基于酰化PreS1抗原衍生肽和短PreS1蛋白结合肽的方法目前正在研究中，已成为新的抗病毒治疗靶点［45］。

目前临床检测HBV复制的实验指标各有其临床意义，但是他们或缺乏特异性，或较难在基层医院普及和推广。广泛使用的抗病毒药物虽有一定疗效，尚无有效合理评价疗效的指标，无法确定停药时间，停药后是否会复发或反弹亦缺乏有效预示指标。随着HBV-LP在乙型肝炎发病机制、感染与病毒复制等方面研究地逐渐深入，以及分子生物学、免疫学和计算机等技术的迅速发展，HBV-LP具有越来越重要的临床价值，为积极寻找临床隐匿性HBV感染的检测策略提供了血清学参考。

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