张文静， 崔丽艳， 张 捷

(北京大学第三医院检验科，北京100191)

“自噬”(autophagy)是广泛存在于真核细胞生物中的一种细胞自我吞噬的现象，在正常生理状态下，细胞自噬维持在很低的基线水平，用以清除衰老的细胞器及降解异常积聚的蛋白质，从而保持机体内环境的稳定。当细胞处于饥饿、生长因子缺乏或高能量需求状态时，自噬水平迅速上调。目前，已有研究发现自噬参与多种疾病的发生过程，如感染、肿瘤、神经元退变性疾病和心脏疾病等［1］。其中心、脑、肾等疾病的发生均与缺血再灌注损伤密切相关。研究表明自噬在缺血再灌注损伤中发挥重要作用，因此，自噬也与这些疾病的发生发展密切相关。然而，在缺血再灌注损伤发生的过程中自噬究竟是发挥保护性作用还是进一步加重损害目前仍无定论，本研究将就自噬及其在缺血再灌注损伤中的作用进行综述。

一、自噬及其生理意义

真核细胞可以通过泛素-蛋白酶体系统和自噬这两种方式来降解蛋白质，其中自噬主要负责降解长寿命蛋白和一些细胞器。自噬是一个动态的过程，当自噬被诱导后，首先在细胞内出现单层膜结构，进而单层膜凹陷形成双层膜样的分隔膜，完全包裹胞内待降解物成为自噬体，最终被运送至溶酶体并被溶酶体降解［2］。根据底物进入溶酶体途径的不同，自噬可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬这3种类型，它们在分子机制和功能方面截然不同［3］，其中，人们对巨自噬的研究最为广泛而深入，通常所说的“细胞自噬”主要是指巨自噬。

当细胞处于营养缺乏的状态时，清除胞内耗能且无用的蛋白质及细胞器变得十分必要，此时通过自噬可以将其降解并产生能量供细胞利用。因此，自噬一直被认为是细胞的一种保护性作用，在维持缺血缺氧等应激状态下细胞存活、清除细胞内衰老细胞器及错误折叠蛋白中起重要作用［4］。然而，过度的自噬不但不能起到保护细胞的作用，反而会促进细胞的死亡，这样的死亡细胞不具备凋亡的典型特点，如核固缩、核破裂、细胞皱缩，没有凋亡小体的形成，也不具备细胞坏死的特点，是不同于调亡和坏死的一种新的细胞程序性死亡，被称为自噬性细胞死亡或Ⅱ型程序性细胞死亡［5］。

二、自噬的诱导和分子调控

自噬作为一种重要的物质代谢方式，其发生发展受到严格的调节和控制，通常是由自噬相关基因(Atg)来调节的。目前研究已经发现在酵母菌及其他真菌体内至少存在32种Atg［6］，其中大部分的Atg基因在高等真核细胞生物中也是保守存在的并发挥相似的功能。

自噬的发生过程可以被划分成4个独立却又连续的步骤:(1)接受自噬诱导物的刺激并诱导自噬;(2)自噬体的形成;(3)自噬体与溶酶体膜的融合;(4)自噬体的降解［7］。参与自噬的有3个关键的蛋白复合物，包括Atg1复合物、雷帕霉素作用靶点复合物1(TORC1)和Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶复合物(PI3K)［6］。在自噬过程中，他们发挥各自不同的作用。

当细胞受到细胞外的(如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等)和细胞内的(如代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等)刺激后，TORC1作为饥饿感受器，可感受细胞的营养状态［8］，并激活AMP-活化蛋白激酶(AMPK)，使mTOR磷酸化并使其活性下降［9］。实验证明，营养缺乏或直接使用雷帕霉素抑制mTOR活性，很可能同时激活某种磷酸酶，导致Atg13部分脱磷酸化，使之与Atg1紧密结合［10］，这种结合可以使Atg1活化，为自噬体的形成奠定基础［7］。除此之外，自噬体的聚集和形成还需要一个关键的复合物，就是Ⅲ型PI3K复合物，其中包括哺乳动物自噬相关蛋白Beclin1，能够招募其他的结构蛋白到自噬体的膜上［11］，有助于自噬体的形成。与此作用相反的是，I型PI3K却可以通过Akt抑制自噬的发生［12］。

三、自噬在缺血再灌注损伤中的作用

缺血所引起的组织损伤是致死性疾病的主要原因，如心肌梗死、脑卒中、肝肾缺血等。大量研究发现对组织造成损伤的主要因素，不是缺血本身，而是恢复血液供应后，过量的自由基攻击这部分重新获得血液供应的组织内的细胞造成的，被称为“缺血再灌注损伤”。

目前，大量的科学研究表明，当器官发生缺血再灌注损伤时，机体会上调自噬水平。通过电镜观察自噬体形成，或者通过检测Atg的mRNA和蛋白水平等方法均可证实这一结论。对大鼠心脏进行缺血处理后，能观察到心肌细胞内自噬体明显增加［13］，在缺血再灌注的胎鼠心肌细胞内也发现了自噬增强的证据［14］。同时，Rami等［15］发现在脑缺血灶中细胞死亡的同时伴有Beclin1表达的升高，说明细胞死亡同时伴随自噬的发生。Suzuki等［16］在肾脏发生缺血再灌注损伤的小鼠模型和人的移植肾活组织标本中均发现肾小管上皮细胞中自噬体增多的现象，说明在肾脏发生缺血再灌注损伤时自噬水平也是上调的。因此，在发生缺血再灌注损伤时自噬增强是毋庸置疑的。但是，研究结果显示，虽然自噬在心肌缺血中起保护性作用，但在再灌注阶段对心肌有害［17］。可见，在缺血阶段和再灌注阶段自噬发挥的作用是不同的，其分子机制也有所不同，以下将分别进行阐述。

1.自噬在器官缺血缺氧时发挥的作用及其相关分子机制 近年来，大量利用缺血缺氧动物模型和细胞培养的实验已经证实了自噬不仅对营养缺乏状态下的细胞起保护作用，而且能促进细胞存活。Kim等［18］观察到处于冬眠状态的心肌细胞内自噬体明显增加，自噬相关蛋白Beclin1水平上调，同时心肌细胞的调亡水平下降，心肌梗死面积减小，说明自噬的增强对缺血的心肌细胞起到了保护性作用。正常的新生鼠在出生后短期内能通过提高自噬来维持存活，而敲除了自噬相关基因Atg5或Atg7的新生鼠出生后很快死亡［14］。该现象进一步证实了自噬在器官缺血阶段对细胞的保护性作用。

在器官缺血缺氧阶段，细胞内的ATP水平明显下降，导致 AMP/ATP比例增高，此时，AMPK作为感受器能接受能量减少的信号而被激活，AMPK的激活不仅通过磷酸化TSC2而抑制了mTOR的活性，而且促进了eEF2的磷酸化。该过程能够抑制蛋白质合成，诱导自噬产生，帮助机体适应缺氧环境［19］。Matsui等［17］通过构建转基因小鼠心肌缺血再灌注模型，对心肌细胞使用AMPK的抑制剂后，观察到心肌细胞内微管相关蛋白轻链3的Ⅱ型与Ⅰ型之比(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)的比值减小，自噬作用被抑制，细胞死亡数目增加，证实了AMPK-mTOR途径是心肌缺血时自噬产生的主要信号通路。

除了mTOR途径以外，凋亡相关蛋白Bcl-2在细胞缺血缺氧时被磷酸化，从而失去与Beclin1的结合作用，同样可以诱导自噬的产生。因此，抑制Bcl-2蛋白能抑制Beclin1依赖性自噬，可能是缺血缺氧状态下主要的非mTOR的自噬调节途径［20］。另有报道，缺氧诱导因子-1(HIF-1)在细胞缺血缺氧时可以通过上调表达水平来促进自噬的产生［21］。以上研究结果显示，在细胞缺血缺氧阶段，机体主要通过mTOR途径诱导自噬的产生，从而起到保护细胞、促进细胞存活的作用，其作用机制有可能是通过抑制凋亡而促使缺血细胞存活［22］。有关这方面机制的研究仍需进一步探讨。

2.自噬在器官再灌注阶段发挥的作用及其相关分子机制 尽管有人猜测当器官出现再灌注时，随着缺血状态的缓解，自噬也应该逐渐减弱，但事实证明在再灌注阶段自噬是增强的［17］。而过度的自噬会导致自噬性细胞死亡，这种自噬性细胞死亡常常伴随细胞凋亡和细胞坏死的现象，因此有人猜测自噬过度时，有可能会触发细胞的凋亡程序而引起细胞死亡［23］，同时，也有研究认为自噬和细胞凋亡是同时存在的，并且它们之间存在相互协作与相互制约的双重作用［24］。研究结果显示，一些被我们所熟知的凋亡诱导物能够同时激活自噬［25］，说明自噬与凋亡在分子调控通路上存在相同的调控物。但是，到目前为止，对于究竟是自噬诱导细胞凋亡还是自噬伴随细胞凋亡这一问题仍存在争议。

Gotoh等［26］构建了大鼠肝脏的缺血再灌注模型，发现在再灌注阶段，自噬增强，肝细胞大量脱落并阻塞肝血窦，使得肝脏大面积坏死。Suzuki等［16］对同种异体肾移植的鼠肾进行缺血再灌注，并利用自噬抑制剂3-MA抑制自噬，发现细胞死亡的数量减少。除此之外，通过对小鼠进行Beclin1基因敲除，再进行缺血再灌注模型的构建，发现基因敲除后小鼠心肌细胞的自噬和凋亡水平均下降，心肌梗死面积减小［27］。Matsui等［17］通过实验证明在心肌再灌注阶段，细胞自噬作用的上调主要靠Beclin1的表达增强。通过抑制Beclin1的表达，可抑制细胞在再灌注阶段的自噬作用，减轻心肌自噬性细胞死亡程度。说明在再灌注阶段，过度的自噬可以加重细胞损伤并导致细胞的自噬性死亡，其主要机制可能与Beclin1与Bcl-2之间的相互作用相关。近来也有人发现活性氧ROS在鼠心脏的缺血/再灌注中对于上调Beclin1的表达及诱导自噬中起关键作用，而这一作用在再灌注阶段尤为重要［28］。说明在细胞再灌注阶段，机体主要通过Beclin1的表达增强进一步加重自噬，最终导致细胞的死亡。

综上所述，自噬是机体在缺血/再灌注损伤时的一种生理性反应，主要通过激活AMPK并抑制mTOR途径诱导自噬的产生，有可能通过抑制细胞凋亡对缺血细胞起到保护性作用，然而，在再灌注阶段，自噬的产生主要依赖于Beclin1的表达增强，过度的自噬在再灌注阶段不利于细胞存活并加重细胞损伤，甚至导致细胞死亡，其作用机制主要与Beclin1与Bcl-2之间的相互作用相关。随着人们对自噬研究的不断深入，将来我们可以通过对自噬信号通路上的信号分子进行人为干预，从而调整自噬水平，作为一种治疗手段来尽可能减轻缺血/再灌注损伤用以治疗相关疾病。

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