马沛勤，苏仙绒，陈 莉

(运城学院 生命科学系，山西运城044000)

随着分子生物学的快速发展，分子遗传学、发育遗传学等现代生物学内容编入本科遗传学教科书中(如基因转座子遗传分析、基因表达调控、免疫遗传分析、基因组学与后基因组学等)，教科书内容发生了转折性的改革。渐渐地，经典遗传学内容部分在教科书中的比重不断减少，如刘祖洞在1991年主编的《遗传学》中，经典的三大遗传规律内容约占38%，而戴灼华在2008年主编的《遗传学》中，三大遗传规律内容约占21%。但是，配合遗传学教学的本科遗传学实验，在地方性院校却几十年如一日，仍然停留在验证遗传规律和染色体制片观察等经典遗传学内容上，反映现代遗传学内容的实验并没有或很少进入本科遗传学实验的课堂。究其原因是多方面的，如实验材料、实验经费、实验设备、实验准备、实验操作、实验学时及实验安排等都是限制因素。本实验改革以2006年张文霞主编的《遗传学实验指导》为参考，尝试将果蝇的GAL4-UAS系统引入遗传学实验，实现基因的表达。在本科遗传学实验中引入分子遗传学的理念。

1．GAL4/UAS系统

GAL4蛋白是酵母中的一类转录因子，它能够与特定的上游激活序列(Upstream Active Sequences，UAS)结合，并驱动UAS下游基因的表达。

1．1 GAL4/UAS系统的表达调节

半乳糖是通过转化为6-磷酸葡萄糖后进入糖解途径而被酵母利用的。从半乳糖的运输到6-磷酸葡萄糖的转化，需要C A L Z(透性酶)、G A LI(激酶)、G A L7(转移酶)、G A LI O(差向异构酶)和G A L S(变位酶)等的参与。这些gal基因的转录是被紧密调控的。gal4基因编码一种能结合上述基因上游DNA序列(UAS)并激活这些基因转录的GA L4蛋白，是一种转录因子。GAL4蛋白共有881个氨基酸，包括N端的DNA结合域、转录激活区域、GAL80结合域、核定位信号区几个功能域。UAS是GAL4蛋白的结合位点，每个UAS含有数目不同的结合单元，结合单元的一致序列为CGGA(GC)GACATCAGGCAGGC［1］。在 G A L4 存在下，UAS是能增加任何基因转录的模式元件，其相互作用与方向和距离无关，是一种增强子序列。

1．2 果蝇GAL4/UAS系统的构建

黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)属于昆虫纲、双翅目、果蝇科、果蝇属，具有许多优良的特性。①易于实验室培养，生活周期短，后代多;②每条染色体都有人工构建的平衡染色体，抑制重组并便于基因的定位;③携带的容易识别的标记基因是遗传筛选必不可少的工具;④巨大唾液腺染色体可直接观察染色体畸变;⑤雄性果蝇的染色体不会发生减数分裂重组;⑥丰富的遗传工具和不同的突变体库。这些特点使黑腹果蝇成为重要的遗传学研究模式动物。

果蝇的GAL4-UAS系统是果蝇遗传学研究中常用的基因表达工具之一。1993年，Brand和Perrimon将酵母的GAL4/UAS序列引入到果蝇中，发明了双向法，将GAL4作为驱动者，在上游连接组织性特异表达基因的启动子序列，UAS作为应答者，在下游连接靶基因，通过显微注射的方法将这两部分分别整合在不同的转基因果蝇中。含有UAS-靶基因的转基因果蝇品系，因为没有驱动者，靶基因不会在亲本中表达，只有在与驱动者GAL4品系杂交后的子一代中，靶基因才会表达。这样在时间上可以控制靶基因的表达。基因表达的位置和组织取决于GAL4前面连接的组织特异性表达的启动子序列［2］。因此利用不同的、特异的GAL4转基因果蝇可以控制靶基因在不同组织的表达。

构建转基因品系的载体是P因子的骨架。果蝇的P因子(P-element)是果蝇自身的一种转座子，可以在其自身产生的转座酶的作用下，在果蝇的基因组内转座。通过剔除P因子内转座酶基因，使其成为转基因的载体［3］。PGAWB是基于P因子建立的可以表达GAL4蛋白的载体，包括gal4基因，hsp70终止子。通过在gal4基因上游插入特异的启动子，利用转基因技术可以构建一系列在不同时期、不同组织内表达 GAL4蛋白的果蝇品系。P UAST也是基于P因子的载体，可供插入靶基因。PUAST包含5个UAS重复片段，hsp70启动子，多克隆位点，以及SV40小 t内含子和 polyA序列［4］。UAS的下游可以连接不同性质的基因序列，如连接靶基因的小干扰RNA(siRNA)序列，在GAL4的驱动下可以达到基因下调的目的［5］;UAS下游连接绿色荧光蛋白(GFP)基因，可以达到标记特异细胞的目的。GAL4/UAS系统已成为一种转基因技术体系。

1．3 eyeless-GAL4和 UAS-Rasv12转基因果蝇品系

1．3．1 eyeless-GAL4 转基因果蝇品系

eyeless-GAL4是只在复眼内特异表达GAL4蛋白的转基因果蝇品系。

果蝇的eyeless(ey)基因是果蝇复眼发育所必须的基因，与人的Pax基因同源［6］(一个在进化上相当保守的基因家族，它们编码的产物是一类极为重要的转录调控因子，存在于从果蝇到人类的各种生物体中，参与细胞内信号传导通路的调控，在胚胎发育过程中对细胞分化、更新、凋亡起重要的调控作用，影响器官和组织的形成)，在神经系统的发育及眼睛的形态发生过程中起重要作用。果蝇eyeless基因突变会导致眼睛结构上的缺陷或复眼完全消失。eyeless最早表达于胚胎时期的神经系统，在幼虫阶段持续地影响复眼发育。若将eyeless基因异位表达在复眼以外的部位，如使用dpp-GAL4(dpp是特异表达在肢体的基因的启动子)驱动UAS-eyeless在果蝇的翅、足及触角上表达eyeless基因后，可以观察到长在翅、足或者触角上的红色复眼小眼面。说明eyeless基因的功能确实是与复眼的生长发育相关eyeless-GAL4表示GAL4蛋白只在复眼内表达。

1．3．2 UAS-Rasv12转基因果蝇品系

UAS-Rasv12转基因果蝇品系是一种含有靶基因ras的UAS果蝇品系。ras基因是研究较为深入的一个原癌基因(oncogene)，最早在病毒中发现，后来在人类、果蝇、线虫、及酵母等生物中也发现该基因的同源基因。ras基因的产物具有很强GTP结合作用和GTP酶活性，通过GTP和GDP的相互转化可以有节制地调控细胞的生长、增值和分化等重要生理过程。作为原癌基因的ras基因被激活以后就变成有致癌活性的癌基因，与GTP解离减少，失去GTP与GDP有节制的调节，导致细胞持续生长，并阻止细胞的自我毁灭、凋亡［7］。

基因突变与基因大量表达都会激活ras基因。ras基因的任何突变都使正常的RAS蛋白转变为能够使NIH/3T3细胞(NIH 3T3是由美国国立卫生研究院(简称NIH)所建立的小鼠胚胎成纤维细胞系，其特点是每3天传代一次，每次接种3×105cells/ml。该细胞系在实验室常用来做转染及基因表达的研究。)转化的蛋白，并在裸鼠中诱导肿瘤的形成。Rasv12为ras基因的一个突变体。在ras基因附近插入一个强起动子(Promoter)或增强子(enhaner)或能被GAL4诱导的UAS，都能使ras基因表达增强。

2．GAL4/UAS果蝇系统在遗传学实验中的构建与实践

实验题目:GAL4/UAS系统诱导ras癌基因在果蝇复眼中异位表达

实验材料:黑腹果蝇野生型;黑腹果蝇转基因品系eyeless-GAL4，黑腹果蝇转基因品系UASRasv12。实验材料由北京大学张文霞副教授果蝇实验室提供。

实验目的:了解如何通过GAL4-UAS系统在模式动物黑腹果蝇中实现靶基因的时空表达。认识GAL4-UAS系统在研究果蝇遗传发育中的重要性和优越性;理解分子调控、靶基因表达与个体的遗传和发育每个环节都是可以操作和控制的现代遗传学实验理念。

实验原理:将eyeless-GAL4驱动者转基因果蝇品系与应答者UAS-Rasv12转基因果蝇品杂交，杂合子代体内转录因子GAL蛋白与UAS序列结合，诱导下游ras基因在复眼原基细胞中表达。

实验器具及试剂:同果蝇杂交实验。

实验步骤:

①以eyeless-GAL4或者UAS-Rasv12转基因果蝇品系为母本，另一品系为父本，挑处女果蝇和雄性果蝇各7～8只，放入新鲜培养基中(25℃)培养。

②一周后，移去亲本，继续培养。

③至子一代成虫羽化(ras基因的过量表达会引起果蝇的生长延滞，因此生活周期较野生型果蝇长)，观察子一代成虫复眼与野生型成虫复眼的差异［2］。

作业:拍照F1果蝇复眼与野生型果蝇复眼的差异，说明差异的原因。

3．将GAL4/UAS果蝇系统引入本科遗传学实验的优势

GAL4/UAS系统诱导ras基因在果蝇复眼中异位表达实验要求与果蝇杂交实验同步进行，不需要增加实验学时和专门安排实验时间，不需要增添任何的仪器设备与试剂，实验准备简单、省时省工，学生的实验操作熟练、结果准确。更重要的是:学生通过对实验结果的直接观察，了解了GAL4-UAS系统的分子调控机制;理解了基因在的形态发生中的作用、基因的调控作用和表达方式;认识了GAL4-UAS系统在研究果蝇遗传发育中的重要性和优越性;也认识了功能基因组学研究和基因工程技术的作用;对分子遗传学的认识由一个抽象的东西变成一个具体的东西，由一个想象的东西变成一个现实的东西。

［1］刘巍峰，高东．酿酒酵母GAL基因的表达调控［J］．微生物学通报，1998(2)．

［2］张文霞，戴灼华．遗传学实验指导［M］．北京:高等教育出版社，2007．

［3］刘晓隽，袁小京等．用增强子陷阱技术构造并筛选果蝇UAS/GAL4系统中GAL4新品系及脑基因表达图谱数据库的开发［J］．生物化学与生物物理进展，2008(6)．

［4］李春峰，夏庆友，周泽扬．GAL4/UAS系统在转基因技术中的应用研究进展［J］．生物技术，2006(1)．

［5］刘勇，张梅超，韦有恒，马维骏GAL4/UAS系统在果蝇Tis11基因RNA干扰中的应用［J］．生命科学研究，2012(3)．

［6］李莉，杨洋，薛磊．Pax基因家族在果蝇发育过程中的调控作用［J］．遗传，2010(2)．

［7］吴越．利用GAL4/UAS系统筛选人类功能基因及Ras在果蝇眼中抑制细胞凋亡的机制［D］，复旦大学博士论文集，2006．