谢仁卓玛, 张立成

(1.青海省海南州畜牧兽医工作站,813000；2.青海省动物检疫站，810007)

猪气喘病，又称猪支原体肺炎，猪地方性肺炎，是由猪肺炎支原体（Mycolasma hyopneumoniaw，Mhp）引起的一种猪慢性、接触性呼吸道传染病，具有气喘和咳嗽、患病猪只生长缓慢和发育不良等特点。Mhp经常与圆环病毒等其他肺部病原体混合感染，易造成更大的经济损失。本研究从发病猪病料中分离、鉴定获得了1株猪肺炎支原体，为该病病原研究提供了基础。从猪喘气病病例中分离得到1株病原菌，对病原菌进行分离培养、姬姆萨染色、致病性及攻毒再分离等鉴定，确定分离到的病原菌为猪肺炎支原体，并命名为Bz1株。

1 材料与方法

1.1病料的采集和处理 病料采集于某猪场疑似患有猪喘气病的猪肺部，用研磨法对肺部组织进行处理。取1 g病变与健康肺脏交界处的组织剪碎，按1:1比例加入生理盐水，用研钵充分研磨，并用0.45μm的滤膜过滤，收集滤液。操作应在无菌条件下进行。

1.2培养用培养基 采用的是KM2猪肺炎霉形体培养基。液体培养基配方：乳清蛋白水解物10.0 g，新鲜酵母浸出物20.0 g，Eagles氏液1000.0 mL，Dulbecco磷酸缓冲液600.0 mL；健康猪血清400.0 mL，0.4%酚红3.5 mL，1%的醋酸铊25.0 mL，青霉素40万IU，pH为7.4～7.6。加入1%琼脂粉即可制成固体培养基。

1.3菌株分离 将1.1收集的滤液，按1:5的比例加入KM2培养基中，37℃静置培养3 d～7 d，观察其培养基颜色变化和透明度情况。当培养基颜色呈现透亮的黄色时，划线接种固体培养基37℃培养7 d～10 d，观察菌落生长情况。

1.4染色并镜检 本研究用姬姆萨染色法进行染色。姬姆萨染料0.6 g溶解于50 mL甘油中，55℃水浴2 h，再加50 mL静置1d以上，滤膜过滤后即得姬姆萨染液原液，染色前每60 mL蒸馏水中加一滴原液，制成姬姆萨染色液。培养物制成涂片，自然干燥，用甲醇固定3min（或用火焰固定），再用磷酸盐缓冲液（pH7.2）稀释20倍的姬姆萨染液染色3h水洗，丙酮浸染，然后镜检。

1.5菌株的致病性试验 将经培养试验和姬姆萨染色鉴定呈阳性的猪肺炎支原体新鲜培养物5 mL直接气管注射3头健康猪，同时设2头健康猪作为阴性对照。攻毒后按常规饲养，饲料中无抗生素。攻毒后28 d内逐日观察，攻毒后28 d剖检试验猪。

1.6攻毒猪病变肺中支原体的再分离 用1.3的方法从攻毒猪病变肺中进行猪肺炎支原体的再分离，并用1.4和1.5的方法进行鉴定。

2 结果

2.1菌体分离及培养结果 分离菌株培养3d后，培养液开始呈现黄色并保持透亮，肉眼观察可见细小的悬浮物出现。固体培养基上可观察到圆形凸起、表面粗糙、边缘整齐的菌落。

2.2染色及镜检结果 取培养物涂片，经姬姆萨染色染色，可观察到球状、环状、椭圆形或两极型、单个或聚集的菌体，无杂菌污染。

2.3致病性试验攻毒猪出现咳嗽、喘气等临床症状，攻毒28 d后剖检攻毒猪，肺部出现典型猪支原体肺炎病变。

2.4攻毒猪病变肺中支原体的再分离 将攻毒猪肺按1.3的方法再分离猪肺炎支原体，传代培养后显示pH值下降，涂片染色镜检发现具有支原体特征的菌体。

3 讨论

猪喘气病病原菌猪肺炎支原体的分离鉴定工作非常困难，由于其营养要求高且生长缓慢，往往被猪鼻支原体、絮状支原体、滑液支原体掩盖。本研究采用KM2培养基进行分离和培育，该培养基营养成分丰富、检出率高、方便实用。本研究采用研磨法对病料进行处理，可以使猪肺炎支原体更多的暴露在培养基中，与剪碎法、灌洗法、匀浆法相比，虽然研磨法对猪肺炎支原体生长影响比较大，但是检出率高，因此选用研磨法处理猪肺炎支原体病料是首选方法。本研究分离到的该病原菌，经培养特征、形态观察、镜检、致病性、攻毒再分离等试验，确定分离株为猪肺炎支原体，命名为猪肺炎支原体Bz1株。本研究也充分验证了科赫法则的理论，即一种病原微生物必然存在于患病动物体内；此病原微生物可从患病动物分离得到纯培养物；将分离出的纯培养物人工接种敏感动物时，必定出现该疾病所特有的症状；从人工接种的动物可以再次分离出性状与原有病原微生物相同的纯培养物。猪肺炎支原体是猪呼吸道疾病综合症的一种原发性病原，能引起猪地方流行性肺炎。分离获得该病的具有致病力毒株将对该病的发病模型建立提供基本材料。

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