胡恒宇，顾贵洲，张 强，赵东风，刘春爽

（中国石油大学（华东）化学工程学院，山东 青岛266580）

对老油田进行深度开发、提高原油采收率已成为当前老油田开发的中心任务。微生物在地层中就地产气，是提高原油采收率的重要途径。微生物在油藏中代谢产生气体、生物表面活性物质、有机酸［1］等，能提高能源利用效率，残余油微生物气化技术是延长油藏开发寿命的新技术，在厌氧环境下，利用产甲烷微生物菌群将石油烃转化为甲烷气，然后直接开采或就地储存起来。烷烃厌氧微生物降解产甲烷过程是多种菌参与、多步骤的反应，影响因素非常多［2－6］，主要因素之一就是烃的化学性质，特别是溶解性［7］。加快原油厌氧降解速度的可行方法之一就是加强厌氧微生物对石油烃的摄取能力，而微生物大多生活在水相中［8－9］。在微生物强化石油开采技术中，营养物质和外源微生物的注入不仅可以提高原油采收率，而且微生物还能利用一些廉价的可再生资源生产大量副产品［10－11］。

根据微生物的特性，可将油藏中的微生物划分为若干个种群，大致包括：烃氧化菌、发酵菌、硝酸盐还原菌、铁还原菌、硫酸盐还原菌和产甲烷古菌。作者在此对其中的硫酸盐还原菌、铁还原菌、硝酸盐还原菌降解残余油产甲烷气的研究进展进行综述。

1 厌氧降解烃的微生物

通过筛选培养的方法，人们在油藏内部分离得到了多种不同功能的厌氧微生物，主要包括硝酸盐还原菌、铁还原菌、硫酸盐还原菌、发酵菌和产甲烷古菌［12］等。20世纪80年代后期，Vogel等证明了烃的厌氧降解过程是可以发生的［13］，Lovley等［14］分离得到了第1株以三价铁为电子受体的高效降解甲苯的菌株GS－15，Aeckersberg等［15］分离得到第1株以硫酸盐为电子受体的能利用长链饱和烃的还原菌Hxd3。大量研究［16－21］证实，厌氧的电子受体一般包括硫酸盐、硝酸盐、三价铁、锰离子、二氧化碳等。

1．1 硫酸盐还原菌

硫酸盐还原菌是一类以硫酸盐为电子受体的厌氧微生物，广泛存在于土壤、海水、河水、地下管道及油藏等缺氧环境中。研究发现，硫酸盐还原菌在富含石油烃的环境（如烷烃、苯及苯系物的环境）中也能生长，并从这些环境中分离出了多种硫酸盐还原菌［22］。分离自海洋沉积物的硫酸盐还原菌株Tol2可以降解甲苯，但是甲苯不能超过一定浓度，否则对菌株有毒性，同时有2种脱氢酶参加了降解反应［23］。

Beller等［24］从石油污染土壤中分离得到了菌株prtol1，它是一种硫酸盐还原菌，以甲苯为唯一电子供体和碳源，降解甲苯为二氧化碳，其中15%转变为非挥发代谢物。Harms等［25］在烷基苯培养实验中分离得到2株培养菌oXyS1和mXyS1，它们以硫酸盐为电子受体，分别能降解邻二甲苯和间二甲苯，并且都有降解苯甲酸和苯甲酸甲酯的能力，16SrRNA序列分析表明：oXyS1与已知菌株Desulfobacterium cetonicum和Desulfosarcina variabilis相似值分别达到98．4%和98．7%，而 mXyS1与 Desulfococcus multivorans相似值为86．9%。Kniemeyer等［26］在芳香烃的厌氧降解实验中得到1株能够降解乙苯的以硫酸盐为电子受体的菌株，该菌株能在含有乙苯的培养基上生存，通过富集培养来自不同地区的海洋样本，发现乙苯的降解依赖于硫酸盐的还原，通过气相色谱－质谱可以检测到降解产物。Morasch等［27］从煤气厂废水中分离培养1株严格厌氧菌，能降解甲苯、邻二甲苯、间二甲苯，并且能将它们完全氧化成二氧化碳，并从细胞提取液中发现了苄基琥珀酸和甲基富马酸。Ommedal等［28］从油藏中发现了1株硫酸盐还原菌，能够降解甲苯，为革兰氏阴性，最适生长温度34～38℃，最佳盐度1．5%，pH 值7．2～7．5，细胞形态呈杆状。Aeckersberg等［15］从含十六烷的富集培养基中得到1株厌氧菌HXD3，能利用硫酸盐为电子受体并将其还原为硫化氢，可以降解C12～C20的长链烷烃；以十六烷为电子供体，在脱氢酶的作用下氧化降解，不过厌氧烷烃的氧化第一步是未知的。

Galushko等［29］从海洋沉积物中富集培养硫酸盐还原菌，在萘存在的富含硫酸盐的沉积物中，以萘为唯一碳源和电子供体，硫酸盐被还原成硫化物，萘被完全氧化为降解产物。有学者从海洋沉积物中分离得到2株菌HXD3和pnd3，都是以硫酸盐为电子受体的严格厌氧菌，对C12～C20烷烃有明显的降解作用，2种菌株共享90%的16SrRNA序列，以降解十六烷为例，降解初期细胞中主要含有脂肪酸［30］。有学者从石油污染的河口沉积物中分离得到降解烷烃的硫酸盐还原菌，此菌种为革兰氏阴性杆菌，可以降解C13～C18长链烷烃，而且以脂肪酸、甲酸盐为电子供体，硫酸盐、亚硫酸盐为电子受体［31］。Cravo－Laureau等［32］研究了正构烷烃的代谢情况，提出了正构烷烃代谢的可能途径，再一次证明了正构烷烃降解为脂肪酸的路径，尤其是通过气相色谱－质谱检测到产生的琥珀酸可说明正构烷烃的厌氧代谢方式。有学者从含油废水的储存设施和油田生产水中分离得到1株新的菌株Desulfoglaeba alkanexedens，能够降解C6～C12烷烃，革兰氏阴性，短杆状，常成对出现，最适生长温度37℃、pH值7．2［33］。从海洋渗漏区的提取物中富集培养得到能够降解短链烃的硫酸盐还原菌［34］。对间二甲苯的降解表明，随着培养时间的延长，会有各种优势菌群占有相应的地位，通过PCR－DGGE分析不同时期的优势序列可以确定优势菌群，采用这种方法确定了1株高效烷烃降解菌，该菌以硫酸盐为电子受体，能降解C6与C10的烷烃［35］。以石油烃为碳源和能源的厌氧生物降解过程，是以硝酸盐和硫酸盐为还原剂，通过延胡索酸羧化和甘氨酰自由基的烷基取代，烷烃被羧化，最终完成降解［36］。

1．2 铁还原菌

有学者分离得到可以降解甲苯和苯酚的厌氧细菌，该菌以三价铁作为电子受体，最后生成二价铁和二氧化碳，使溶液的pH值降低［14］。2001年，又有学者从受石油污染的水层中分离得到严格厌氧菌株，为革兰氏阴性菌，分别属于3个种属，能够降解芳香族化合物［37］。铁还原菌的降解烷烃种类不一样，分离的方法也多种多样，如表1所示。

表1 厌氧降解烃的铁还原菌Tab．1 The iron－reducing bacteria capable of anaerobic degradation of hydrocarbons

铁化合物广泛存在于油藏中，主要有三价铁和二价铁两种形态，在烷烃降解反应时，涉及到氧化还原反应，可以作电子受体。铁还原菌种类繁多，有嗜温和嗜热厌氧菌，有以有机酸、乙酸盐作为电子受体的希瓦氏菌，也有以氢气作为电子供体、乙酸为碳源的菌群，且代谢途径多样化［39，41－42］。

1．3 硝酸盐还原菌

从废水中分离得到1种在厌氧条件下纯培养能够降解甲苯的细菌，初步鉴定为假单胞菌属。该菌以硝酸盐作为甲苯降解的电子受体，也能够降解间二甲苯、苯甲酸、苯甲醛［43］。在厌氧条件下，有学者以甲苯作为唯一碳源分离出能够降解甲苯的菌株，超过50%的甲苯碳被氧化成二氧化碳的碳，29%被吸收，甲苯的降解速率为1．8mmol·min－1·L－1，而且具有不同于其它细菌降解甲苯的途径［44］。有学者用多种芳香族化合物培养基分离出几种假单胞菌属，并且在厌氧条件下，以硝酸盐为电子受体，进行了降解甲苯的实验，得到7株能够降解甲苯的菌株。结果发现，超过50%的14C标记的甲苯碳转变为二氧化碳的碳，厌氧降解甲苯是通过甲基侧链氧化为苯甲酸实现的，而且高达37%的碳被吸收进细胞质。而对甲酚、对羟基苯甲醇、苯甲醛或对羟基苯甲酸的降解更慢或有不同的滞后时间［45］。

反硝化也称脱氮作用，是指反硝化细菌在缺氧条件下，还原硝酸盐并释放出分子态氮（N2）或一氧化二氮（N2O）的过程。能进行反硝化作用的只有少数细菌，这个生物群称为反硝化菌。大部分反硝化细菌是异养菌，例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等，它们以有机物为氮源和能源，进行无氧呼吸。通过16S rRNA基因序列分析、细胞脂肪酸的气相色谱分析、新的系统发育和分类等手段得到8种甲苯降解反硝化菌株。构建的系统进化树反映了各个菌株的种属关系。利用距离矩阵、最大简约法和最大似然方法，证明8种反硝化菌株形成了一个系统发育的相干集群。通过降解产生的脂肪酸和细胞形态，也有类似的生理和营养特性［46］。

在相对较低的甲苯浓度（5×10－6）下，分离得到了10株细菌，其甲苯降解活性为阳性，对芳香族化合物有较强的降解能力。通过PCR指纹分析，表明有8个不同的菌株，所有菌株均是能动的革兰氏阴性杆菌，脱氮产生N2，不水解淀粉，有血红素亚硝酸盐还原酶，但只有4株菌有杂交的固氮酶结构基因。16SrRNA基因分析表明这些菌株属于Azoarcus属［47］。对淡水泥浆样品进行了厌氧降解，从中提取出2个新的反硝化菌EbN1和pbn1，在硝酸盐存在下可以降解烷基苯与侧链长于甲苯的芳烃类，同时能降解乙苯和丙苯。在甲苯和间二甲苯的泥浆中分离得到2个反硝化菌ton1和mxyn1，16SrRNA序列分析表明，新菌株与Thauera selenatis有密切的关系，表现出降解烷基苯的特定能力［48］。通过差异蛋白质组学的方法，找到各种降解途径表达的蛋白，从而分离得到了能够利用芳香族化合物的EbN1。对354种不同的蛋白质进行鉴定，其中199个表现出显著改变的丰度。这些调节蛋白主要体现为不同降解途径的酶，并揭示了不同阶段的生长条件［49］。在反硝化细菌厌氧降解乙苯的初始反应中提取到了EB1，以其在反硝化条件下降解乙苯，69%的14C标记的乙苯转换为14CO2。进一步研究发现，厌氧条件下菌株EB1细胞代谢乙苯，生成1－苯基乙醇、苯乙酮和1个未知的化合物，通过生长实验和光谱分析，提出该未知的化合物是苯甲酰乙酸乙酯。H218O标记表明厌氧降解乙苯的第1个产品是1－苯基乙醇，羟基来源于水［50］。

在生物治理柴油污染含水层时，通过注射原位氧化剂（O2和NO－3）和添加营养物，可以刺激微生物活性。从含水层样品中分离的细菌菌株能够对选定的碳氢化合物进行厌氧反硝化降解，而且分离的菌株能够生长，菌株T2、T4、T6和T10生长在含甲苯的培养基上，菌株 M3、M7、M9、M11、M12生长在含甲苯和间二甲苯的培养基上，其中菌株T2、T4、T6和T10是球菌，菌株 M3、M7、M9、M11、M12是棒状杆菌。形态和生理的差异也反映在23SrRNA的结构域Ⅲ和16SrRNA序列上，16SrRNA序列分析显示菌株T3和M3属于Azoarcus属。表明降解石油烃的Azoarcus属是土著微生物的重要成员，其中约80%属于β－变形菌、10%～16%属于γ－变形菌［51］。从加利福尼亚州含水层中分离得到的菌株通过三氯乙烯（TCE）的驯化，能够以共代谢方式降解苯酚或甲苯。分别测量这些降解菌的密度，发现它们可能对这些基质相当敏感。基因序列鉴定表明，其中60%为苯酚和甲苯降解菌株。通过甲苯邻单加氧酶（汤姆）探针进行杂交分析探讨可能的降解途径，并鉴定这些菌株为革兰氏阳性菌［52］。

研究表明，厌氧条件下，硝酸盐还原菌能够降解烷基甲苯和二甲苯的3种异构体，对异丙基甲苯（甲基）的降解富集培养最快（4周），对天然芳香烃和二甲苯的降解时间为6周，而对其它烷基苯的降解效果不明显。厌氧烷基苯的降解至少需要2个酶系统的存在，其中1个代谢芳香族和乙基甲苯，另1个代谢甲苯［53］。

有学者富集了Dechloromonas菌株（RCB和JJ），可以完全代谢各种单芳族化合物（包括苯），其中CO2可以作为替代硝酸盐的电子受体，用于污染环境的防治［54］。厌氧降解烃的主要硝酸盐还原菌见表2。

2 结语

随着世界人口的增长，化石能源需求的日益增加以及全球石油资源的减少使人们重新认识到石油产甲烷的重要作用。为更好地利用废弃油藏中的残余油，微生物强化石油开采技术得到大范围应用。

2004年底，俄克拉荷马日报报道了俄克拉荷马大学Suflita教授的研究工作，即通过微生物的作用，将油藏中残余油转化为天然气，可使老油田起死回生［64］。专门从事生物气研究的美国LUCA公司研究Monument Butte油田时发现，该油藏的油和水样在一起培养时，由于微生物作用，在最开始的60d内有大量的甲烷产生，297d时甲烷产生量达到最大。油藏环境中的硝酸盐、四价锰、三价铁、硫酸盐等电子受体耗尽是甲烷产生的基础，而甲烷正是油藏中石油烃降解的终端产物之一。

产甲烷古菌通过与其它细菌形成一种特殊的互营关系，持续降解石油烃并接受末端电子产生甲烷，地质学证据表明，数千年来在地球内部（提供厌氧甲烷条件）油藏自发进行着这种产甲烷进程。处于厌氧生物链最末端的产甲烷古菌在微生物采油、生物修复以及生物圈碳元素循环中起着重要作用。通过加入更有潜力的产甲烷微生物来降解石油烃，取得了很好的效果。

表2 厌氧降解烃的硝酸盐还原菌Tab．2 The nitrate－reducing bacteria capable of anaerobic degradation of hydrocarbons

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