郭水龙，朱圣韬，李 鹏,3，王拥军,3，王 民，邢 洁，郭庆东，孙秀梅，张澍田,3

(1.首都医科大学附属北京友谊医院，北京 100050；2. 消化疾病癌前病变北京市重点实验室，北京 100050；3.北京市消化疾病中心，北京 100050 )

胃癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤，名列全球第二大癌症死亡原因[1]。我国是胃癌高发国，每年新发胃癌患者40万人，发病率在所有恶性肿瘤居首位，死亡人数达30万人，约占所有恶性肿瘤死亡人数的25%～30%[2]。胃泌素受体(也称胆囊收缩素B受体，CCKBR)是生长因子胃泌素(Gastrin)的重要受体， 主要分布于在胃体黏膜的壁细胞和ECL细胞。生理上，CCKBR主要通过与Gastrin结合，调节胃液、胃蛋白酶和胆汁的分泌[3]。近年来的研究发现，Gastrin及其受体CCKBR与胃肠道肿瘤尤其是胃癌的发生密切相关，可作为胃癌早期诊断的重要指标，并可能发展成为胃癌治疗的靶位点[4-5]。miR-148a是最早发现，同时也是最重要的胃癌相关microRNA之一，但目前对其在胃癌中的作用机制还不十分明确[6]。本研究从多个方面证实miR-148a可以靶向CCKBR，揭示了二者参与胃癌发生发展的新的功能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

真核表达载体pIRES2-EGFP购自BD公司，miR-148a Luciferase报告载体pGL3-CM 由pGL3-control改构。BGC-823和293T细胞由本实验室保存。CCKBR抗体购自Abcom公司，

GAPDH抗体和二抗购自中杉金桥公司。各种限制性内切酶和T4多聚核苷酸激酶购自NEB公司。引物和探针合成自Invitrogen公司。质粒抽提及凝胶回收试剂盒购自QIAGEN公司，转染试剂购自Invitrogen公司，双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司，其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 miR-148a靶向CCKBR的生物信息学预测：使用microRNA在线靶点分析工具TargetScan(www.targetscan.org)分析人CCKBR基因3’UTR，发现3处miR-148a的潜在结合位点，分别位于第334、423和476碱基处(图1)。可以看出，miR-148a与CCKBR之间存在很好的靶向关系。

1.2.2 miR-148a真核表达载体的构建：合成miR-148a上下游引物，序列分别为5′- aaaagatctgaacacac ctgcaggaagaa-3′和5′- aaaaaagcttctggcgtctggagcactg-3′，PCR扩增出164 bp的产物序列。PCR产物经切胶回收和连接，插入pIRES2-EGFP真核表达质粒。挑阳性克隆进行测序鉴定。

1.2.3 miR-148a过表达的Northern Blot检测：miR-148a转染细胞后24 h提取细胞RNA，根据文献描述方法进行Northern Blot检测，上样量为20 μg[7]。 miR-148a探针序列为其完全互补序列，使用T4多聚核苷酸激酶将32P 标记5’末端。

1.2.4 荧光素酶活性检测miR-148a对CCKBR 3’UTR的靶向作用： 使用上下游引物5′-ccgctcgagg gttgaggcagggcaaatgac-3′和5′-ccgacgcgtttgggtaaggaagg agagggc-3′ 扩增人CCKBR的3′UTR，并克隆到 pGL3-CM质粒构建荧光素酶报告载体(野生型)。采用引物5′-ccggaattcattgttttaga gactatggagc-3′和5′-ccggaattccattaatctatgtgtgtgag agg-3′；5′-ccggaattcaaaa taccatcaggcctaatc-3′和5′-ccggaatt ctgattgggaagggtcactgt -3′；5′-ccggaattcaaaaggttcttcatccct ttcc-3′和5′-ccggaattcagaacagcctgttggtcaga-3′分别将CCKBR 3′UTR的 334、423和476三处miR-148a潜在结合位点进行突变，构建荧光素酶报告载体(突变型)。将报告载体与miR-148a过表达载体共转染细胞，48 h后裂解细胞，根据试剂说明书进行检测。检测仪器为LB 960 Centro XS3 luminometer。

1.2.5 Western Blot蛋白检测：使用RIPA裂解细胞提取蛋白并检测蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳，上样量为25 ～ 50 μg。半干法转膜，5%脱脂牛奶封闭，一抗(1∶1000)4℃孵育过夜，HRP偶联二抗室温孵育1 h，ECL发光显影。

1.2.6 统计学分析 采用 SPSS 10进行统计分析，数值采用均数±标准差表示，组间数据比较采用t检验，P< 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-148a真核表达载体的构建

图1 人CCKBR 3’UTR 上miR-148a结合位点预测

将构建的miR-148a表达载体(IE-148a)进行测序，结果显示 164 bp的扩增产物(miR-148a前体)正确插入载体中，序列与pubmed数据库完全一致。Northern Blot检测miR-148a载体在BGC-823细胞中的表达(图2)，与空载体Vector相比，过表达组miR-148a的表达量明显增加，证实构建的载体能够在真核细胞中过表达miR-148a，适合下一步实验使用。

图2 Northern Blot 检测miR-148a真核载体表达

2.2 miR-148a通过与3’UTR 423 bp处的靶位点结合，抑制人CCKBR基因的表达

荧光素酶活性检测结果显示(图3)，miR-148a过表达可以明显抑制含CCKBR 3’UTR报告载体的荧光素酶活性，大约为空载体对照组的64%(P< 0.05)，表明miR-148a通过结合3’UTR区可抑制CCKBR基因的表达。当分别将三个预测的miR-148a结合位点突变后，3’UTR 423 bp处的突变可显著消除miR-148a过表达导致的荧光素酶活性降低(P> 0.05)。而3’UTR 334 bp和476 bp处的结合位点突变没有此效应(P< 0.05)，与野生型报告载体的荧光素酶活性相同。结果表明，miR-148a通过与CCKBR 3’UTR 334 bp处结合，直接抑制该基因的表达。

图3 荧光素酶活性分析检测各组报告载体表达(*P < 0.05)

2.3 miR-148a抑制CCKBR蛋白表达

Western Blot结果显示，如图4，与空白对照和空载体Vector相比，miR-148a过表达可显著抑制胃癌细胞BGC-823中CCKBR的蛋白表达。

图4 Western Blot检测各组细胞CCKBR蛋白表达

3 讨论

胃泌素主要由分布于胃窦和十二指肠近端的G细胞分泌，通过与受体结合调节胃酸和组胺的分泌来发挥作用。胃泌素在胃中作用的主要靶点是胃体黏膜的壁细胞和肠嗜铬样细胞(ECL)细胞表面分布的受体CCKBR。小鼠胃CCKBR基因敲除导致ECL细胞减少，胃壁变薄[8]。近年来胃泌素及其受体CCKBR在消化道肿瘤及其癌前病变中的作用越来越引起人们重视。研究证实，胃癌患者胃癌组织中CCKBR的含量明显高于对照正常组织，胃泌素及CCKBR广泛参与胃癌发生发展[4,9-10]。Cui等[11]发现高胃泌素血症的日本绵鼠发生胃癌，该胃癌起源于ECL细胞，而CCKBR拮抗剂YF476可阻止高胃泌素引起的胃癌发生[12]。虽然CCKBR在胃癌发展过程中表达逐渐升高，但其异常表达的机制至今不是十分明确。

microRNA (miRNA)是一类22 bp左右的非编码小RNA，通过序列互补与特异mRNA结合，在转录后水平调控靶基因的表达。我们前期的工作和众多研究组研究结果表明，miR-148a在人胃癌组织中表达下调，并通过作用于不同的靶分子调控胃癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等[13-17]，是重要的胃癌抑制miRNAs之一。我们前期对miR-148a在胃黏膜中的表达定位研究结果显示，miR-148a主要分布于小鼠胃黏膜底部，这一位置主要为壁细胞和ECL细胞等分泌细胞，提示miR-148a可能参与调控胃黏膜的分泌功能[14]。此外，我们前期研究还发现，miR-148a下调是胃癌发生的早期事件，胃癌小鼠模型胃组织中miR-148a在小鼠出生20 d后即观察到50%的下调，60 d后下调约80%[18]，这与胃癌发展过程中CCKBR的逐渐上升是同步的，提示二者之间可能存在调控关系。本研究中，我们首先通过信息学预测，在CCKBR中发现了3个miR-148a的结合位点。然后，通过构建的miR-148a真核表达载体并在胃癌细胞中过表达，我们证明miR-148a可直接与CCKBR的3’UTR结合，抑制其基因表达和蛋白翻译。这一发现，为CCKBR表达调控机制和miR-148a在胃癌中的作用机制提供了新的解释。

目前，国内外研究者都在开发新的胃癌早期诊断标志物和药物作用靶点，而胃泌素及其受体和miRNA是其中的两大热点[9,19-21]。本研究的结果为胃癌早期筛查和治疗提供了新的潜在靶分子，并为下一步的临床研究奠定了基础。

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