郑 翔，刘兴宇，李学英，吴明松

(遵义医学院 细胞生物学与遗传学教研室，贵州 遵义 563099)

ERGIC3主要参与蛋白质从内质网到高尔基体的早期运输，近年的研究显示，ERGIC3在肺癌、肝癌中异常高表达，还参与肺癌[1]、肝癌[2]的发生发展，以及抑制Brefeldin (BFA)诱导的HEK-293细胞凋亡[3]，然而机制尚不清楚。大多数肺癌起源于支气管上皮细胞[4]，因此我们构建了pLXSN-ERGIC3真核表达载体，并将其转染入支气管上皮细胞BEAS-2B，筛选出稳定转染ERGIC3的支气管上皮细胞株，为进一步研究ERGIC3基因在肺癌中的作用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 BEAS-2B细胞、PT-67细胞由中科院昆明动物所曹毅研究员惠赠。定量PCR仪机型为Bio-rad公司产品(型号：iCycler iQ)。pLXSN载体购自美国Clontech公司，DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司，SYB Green购自Invitrogen公司，感受态大肠杆菌DH5α和逆转录酶M-MLV购自Promega公司，Taq酶和ERGIC3多克隆抗体购自Sigma公司，β-actin一抗和HRP标记二抗购自美国Proteintech公司，ECL试剂购自美国Millipore公司。人肺组织为肺癌患者手术后20 min内取材，立即放入液氮中保存备用。

1.2 细胞培养 BEAS-2B细胞和PT-67细胞生长于含10%胎牛血清DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。2～3 d换液，3～5 d传代，细胞处于对数生长期时用于实验。

1.3 引物设计及合成 参照GenBank的人ERGIC3基因序列(NM_198398.1)，用Primer 5.0软件设计PCR引物，P1：5'-GGTGGTGAATTCATGAGGCGCT GGGGAAGCT-3'，P2：5'-GGTGGTGGATCCACCGAGGAGGGTGACTACGTTGT CTT-3'，在引物的5'端分别加上保护碱基GGTGGT和EcoR I、BamH I的酶切序列。定量PCR引物：ERGIC3: F: 5'-GGAGAGGTACTGAGGACAAATCA-3'，R: 5'-AGCTCATAGAGGACGAAGACTC-3'； β-actin: F: 5'-CGGGAAATCGTG CGTGAC-3'，R: 5'-CAGGA AGGAAGGCTGGAAG-3'。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4 人ERGIC3基因的扩增 用TRIzol试剂提取人肺组织总RNA，以其为模板，随机引物为引物，用逆转录酶M-MLV合成cDNA。再以此cDNA为模板，P1、P2为引物，经 PCR扩增得到ERGIC3基因的ORF框DNA片段。反应体系：cDNA模板 5 μL，10×缓冲液10 μL，dNTP(10 mM)2 μL，引物P1、P2(10 μM)各2 μL，高保真Taq 酶2 μL，灭菌水补足体积至100 μL。……