李 状 刘婵桢

(广西医科大学附属肿瘤医院，南宁市 530021)

胸腺五肽对宫颈癌免疫调节作用的体外实验研究▲

李 状 刘婵桢*

(广西医科大学附属肿瘤医院，南宁市 530021)

目的研究胸腺五肽对于宫颈癌局部免疫抑制的调节作用。方法宫颈癌HeLa细胞无血清培养上清浓缩后，对其中重要的免疫抑制因子TGF-β1和VEGF进行定量，作为宫颈癌免疫抑制微环境模型，刺激正常志愿者的淋巴细胞和树突状细胞。结果宫颈癌HeLa细胞培养上清导致正常志愿者淋巴细胞中免疫抑制性的CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞明显增多，树突状细胞成熟受阻，而于其中加入胸腺五肽后则使该现象逆转。结论胸腺五肽在宫颈的局部应用可通过局部免疫调节，阻碍宫颈癌的进展，值得临床研究推广。

宫颈癌；胸腺五肽；免疫抑制

宫颈癌是全世界妇女发病率和死亡率仅次于乳腺癌的第二大恶性肿瘤，每年全球大约有53万新发病例，27万死亡病例，其中80%的新增病例和死亡病例发生在发展中国家，严重威胁女性健康[1]。在我国，每年新发病例约13万人，占世界新发病例的28.8%，发病呈现年轻化趋势，宫颈癌的治疗面临着更为严峻的挑战。目前虽没有证据表明肿瘤的发生与机体的免疫状态有必然的直接因果关系，但肿瘤的发展却与机体的免疫状态密切相关：一方面，肿瘤细胞常表现为弱的免疫原性，可引起机体免疫系统的免疫应答，但由于其免疫原性不够强，不足以激发较强的免疫反应；另一方面，肿瘤细胞通过分泌免疫抑制因子对机体的免疫系统产生抑制作用。因此，免疫调节治疗是传统常规治疗的有益补充。本文应用体外研究方法，探讨如何更好地应用免疫调节治疗方法以延缓宫颈癌的进展。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及上清收集制备 人宫颈腺癌细胞HeLa细胞为广西医科大学肿瘤医学院实验研究部保存，于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液(Gibico，美国)中，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。细胞长满瓶底80%左右，弃去完全RPMI1640培养基，然后于每瓶中加入无血清RPMI-1640培养基8 ml/瓶，并于37℃、5%CO2培养箱中培养3 d后收集培养上清，集中超滤浓缩50倍。

1.2 测量方法 双抗夹心酶联免疫吸附实验测量HeLa上清中免疫抑制因子TGF-β1、VEGF 水平，上述酶联免疫吸附实验试剂盒购自深圳欣博盛公司，并经预实验证明。将HeLa培养上清中调节终浓度VEGF约6 ng/mL、TGF-β约1 300 pg/mL可稳定诱导淋巴细胞及树突状细胞发生变化。

1.3 分离及诱导 健康志愿者外周血经Ficoll淋巴细胞分离液(GE公司，美国)分离为淋巴细胞及单核细胞，其中单核细胞用于诱导为树突状细胞。诱导所需的重组人IL-4、重组人IL-6、重组人肿瘤坏死因子TNF-α、重组人γ干扰素IFN-λ购自以色列Peprotech公司，PGE2购自美国Sigma公司。

1.4 免疫检测 流式细胞分析术检测淋巴细胞中免疫抑制性CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞比例，测定经诱导的树突状细胞中CD83阳性成熟树突状细胞及CD1a阳性不成熟树突状细胞的比例；其中所需的各种抗体购自美国BD公司。

1.5 胸腺五肽处理方法 将胸腺五肽注射液( 商品名：通达，北京市世桥生物制药有限公司)1 mg/mL加入研究体系。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0统计分析软件分析数据，计量资料采用t检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胸腺五肽对淋巴细胞的免疫影响 胸腺五肽对于正常志愿者淋巴细胞中免疫抑制性CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的影响表现：当健康志愿者淋巴细胞培养体系中含终浓度VEGF>6 ng/mL、TGF-β1>300 pg/mL的HeLa细胞培养上清时，CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞比例较加入等比例浓缩的无血清RPMI-1640培养基的对照组显著增高，而在此基础上再加入1 mg/mL胸腺五肽注射液，则CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞比例回落。对照组、HeLa上清组及胸腺五肽组CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞比例分别为(16±2.6)%、(47±6.4)%、(21±3.3)%，各组差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 CD4+CD25+FoxP3+ 调节性T细胞比例

2.2 胸腺五肽对树突状细胞成熟的影响 当健康志愿者树突状细胞诱导体系中含终浓度VEGF>6 ng/mL、TGF-β1>300 pg/mL的HeLa细胞培养上清时，CD83+成熟DC比例较加入等比例浓缩的无血清RPMI-1640培养基的对照组显著降低，而CD1a不成熟DC比例则显著增高，而在此基础上再加入1 mg/mL胸腺五肽注射液，则CD83+成熟DC比例回升而CD1a+不成熟DC比例回落。对照组、HeLa上清组及胸腺五肽组CD83+成熟DC比例分别为(41±5.4)%、(7±5.6)%、(36±4.9)%，各组差异均有统计学意义(P<0.05)；对照组、HeLa上清组及胸腺五肽组CD1a不成熟DC比例分别为(5.1±1.3)%、(9±2.3)%、(5.4±1.1)%，各组差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 CD83+成熟DC及CD1a+不成熟DC比例

3 讨 论

肿瘤微环境(tumor microenvironment)最早于1979年由Lord正式提出，即是肿瘤在其发生发展过程中所处的内环境，由肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管、组织液及少量浸润细胞，如树突状细胞、巨噬细胞等共同组成。肿瘤细胞通过自分泌-旁分泌途径能分泌免疫抑制性细胞因子，使肿瘤局部形成一个深度免疫抑制区，不仅使身在其中的免疫细胞功能受到严重抑制，甚至功能正常、活化的免疫细胞，一旦进入此环境也将成为免疫功能抑制的“沉默”细胞，是肿瘤免疫逃逸的重要机制之一[2]。因此，作为肿瘤免疫效应阶段的执行场所，肿瘤微环境内存在着肿瘤组织与免疫系统的相互作用。该局部微环境包括了肿瘤组织产生的免疫抑制性细胞因子[3]、肿瘤组织诱导产生的免疫抑制性细胞如CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞[4]、肿瘤相关树突细胞[5]等多种免疫抑制因素。

肿瘤免疫抑制微环境在肿瘤发展中的作用被越来越多的研究者所重视，然而针这些研究，目前还没有一个较为成熟的实验模型作为研究载体。因此如何建立一个合理而稳定的研究模型，为后期的研究打下坚实的实验基础是我们首要考虑的问题。为此，我们借鉴浙江大学谢幸教授用卵巢癌细胞系SKOV3培养上清研究卵巢癌免疫抑制微环境的思路[6]，用宫颈癌HeLa细胞体外培养上清以模拟宫颈癌局部微环境，通过测量其中免疫抑制因子水平并进一步对该微环境模型进行均一化，发现以TGF-β1、VEGF为代表的免疫抑制因子出现明显升高，并可刺激免疫抑制性的CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞比例明显升高，CD83+成熟树突状细胞比例降低，CD1a+不成熟树突状细胞比例升高，因此表明该体外环境满足产生免疫抑制性细胞因子、诱导产生的免疫抑制性细胞、诱导产生肿瘤相关树突细胞等相关条件，可以模拟体内的宫颈癌免疫抑制微环境，在此基础上可研究药物对于宫颈癌免疫抑制微环境的调节作用，并进一步寻找改善肿瘤局部免疫抑制状态的临床治疗手段。

胸腺肽是由胸腺的组织上皮细胞分泌的一类多肽激素， 可促进T 细胞的成熟，同时参与神经内分泌系统和免疫系统的交互作用，激活细胞免疫。其中的胸腺肽α1可刺激外周血液淋巴细胞丝裂原，促进载淋巴细胞的成熟，增强抗原或丝裂原激活后载细胞分泌的干扰素-α、干扰素-γ 以及白细胞介素-Ⅱ、白细胞介素-Ⅲ等淋巴因子水平，同时增加T 细胞表面淋巴因子受体水平。胸腺肽α1 还可通过对CD4细胞的激活，增强异体和自体的人类混合淋巴细胞反应。因此，胸腺肽有促进T淋巴细胞转化、调节和增强人体免疫功能的作用[7]。但对于局部肿瘤免疫抑制微环境是否有改善作用尚无研究。因此，我们借助上述研究模型，将商品化胸腺五肽注射液添加至其中以模拟宫颈癌局部注射治疗，发现胸腺五肽可以对抗宫颈癌局部微环境中的免疫抑制细胞因子，降低免疫抑制性细胞及肿瘤相关树突细胞，主要是降低其中免疫抑制性的CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞，从而保证有功能Th细胞比例，并使树突状细胞易于诱导成熟，发挥其抗原提呈作用，打破进入肿瘤微环境中的免疫细胞而成为功能抑制的“沉默”细胞状态，从而打破肿瘤免疫逃逸，发挥局部免疫调节作用。因此，作为辅助治疗手段，胸腺五肽于宫颈局部注射，配合宫颈癌局部放疗及全身化疗，值得临床进行深入地研究。

[1] Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[2] Colombo MP,Piconese S.Regulatory-T-cell inhibition versus depletion:the right choice in cancer immunotherapy[J].Nat Rev Cancer,2007,7(11):880-887.

[3] Liu CZ,Zhang L,Chang XH,et al.Overexpression and immunosuppressive functions of transforming growth factor 1,vascular endothelial growth factor and interleukin-10 in epithelial ovarian cancer[J].Chin J Cancer Res,2012,24(2):130-137.

[4] Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,et al. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases[J].J Immunol,1995,155(3):1151-1164.

[5] Gabrilovich D.Mechanisms and functional significance of tumour-induced dendritic-cell defects[J].Nat Rev Immunol,2004,4(12):941-952.

[6] Li X,Ye F,Chen H,et al.Human ovarian carcinoma cells generate CD4(+)CD25(+) regulatory T cells from peripheral CD4(+)CD25(-) T cells through secreting TGF-beta[J].Cancer Lett,2007,253(1):144-153.

[7] 赵林栋,李 丽,李 伟,等.胸腺肽对复发性尖锐湿疣(CA)的临床疗效及免疫功能的影响[J].中国麻风皮肤病杂志,2001,17(1):59.

Invitrostudyofimmuneregulationfunctionofthymopentinincervicalcancer

LIZhuang,LIUChanzhen

(AffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,Guangxi,P.R.China)

ObjectiveTo study local immune suppression regulation function of thymopentin in cervical cancer.MethodsHeLa cells cultured in serum-free supernatant was concentrated and quantified on important immunosuppressive factors TGF-β1 and VEGF as cervical cancer immunosuppressive microenvironment model to stimulate normal volunteers lymphocytes and dendritic cells.ResultsCulture supernatant of cervical cancer HeLa cell caused normal volunteers′ immunosuppressive CD4+ CD25+ FOXP3+ regulatory T cells increased significantly, dendritic cell maturation blocked. Adding thymopentin made the phenomenon reversed.ConclusionTopical application of thymopentin in cervix impedes the progress of cervical cancer by local immune regulation, and it is worthy of clinical popularization.

Cervical cancer; Thymopentin; Immunosuppression

广西自然科学基金(合同号：2013jjBA40189)

李状(1986～)，女，硕士，住院医师，研究方向：妇科肿瘤临床及基础研究。

R 737.33

A

1673-6575(2014)05-0549-04

10.11864/j.issn.1673.2014.05.05

2014-06-23

2014-08-20)

*通讯作者