石秋艳，刘冰，张春阳，范亚霞，孙原，杨斌

论著·基础

缺血预处理对大鼠脑缺血再灌注自噬的影响

石秋艳，刘冰，张春阳，范亚霞，孙原，杨斌

目的观察缺血预处理后不同间隔时间对大鼠脑缺血再灌注海马自噬的影响。方法参照Zea-Longa线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，将实验动物随机分为3组：假手术组(Sham组，n=10)、缺血再灌注组(I/R组，n=10)、缺血预处理组(IPC组，n=30)，缺血预处理组再按缺血预处理后不同间隔时间分为1 d、3 d、5 d 3个亚组，每组10只。缺血2 h再灌注24 h后用免疫组织化学法检测自噬相关蛋白BECLIN l、LC3-II的表达情况，透射电镜观察神经细胞中自噬和溶酶体的激活以及细胞超微结构的变化。结果(1)神经功能障碍评分：与Sham组比较，I/R组及IPC组均出现不同程度神经功能障碍(P<0.01)，IPC组症状评分低于I/R组(P<0.05)。(2)脑梗死体积：与Sham组比较，I/R组及IPC组均有不同程度梗死灶(P<0.01)；IPC组脑梗死灶体积明显低于I/R组(P<0.01)，3 d亚组梗死体积少于1 d、5 d亚组(P<0.01)。(3)免疫组织化学染色：与Sham组比较，I/R组及IPC组BECLIN l及 LC3-II阳性表达增多(P<0.01)，IPC组阳性表达显著低于I/R组(P<0.01)，IPC 3 d亚组阳性表达低于1 d、5 d亚组(P<0.01)。(4)脑组织超微病理形态改变：Sham组细胞正常；I/R组及IPC组可见数量不等、处于不同时期的自噬体和或自噬溶酶体，线粒体肿胀，膜破裂，可见空泡，各级溶酶体显著增多，可见变形次级溶酶体，高尔基体分裂；IPC组自噬体及各级溶酶体数量较I/R组减少，各IPC亚组间自噬体及各级溶酶体数量无可见变化。结论缺血预处理可能通过下调自噬水平减轻缺血再灌注损伤，缺血预处理3 d优于1 d、5 d。

自噬；缺血预处理；缺血再灌注损伤；BECLIN l；LC3-II

缺血性脑血管疾病严重威胁人类生命和健康，在治疗过程中容易发生缺血再灌注损伤，研究怎样减轻缺血再灌注损伤具有十分重要的意义。缺血再灌注损伤可导致细胞死亡，过去认为坏死和凋亡是细胞死亡的主要形式，现在一种新的细胞死亡方式——自噬性细胞死亡，越来越受到研究者的重视。缺血预处理是在缺血再灌注之前，预先给予组织或器官短暂的间断缺血，使其能够增加对随后长时间缺血再灌注所造成组织或器官损伤的耐受性。缺血预处理减轻缺血再灌注损伤是通过激发内源性保护机制，但其对脑组织自噬的影响尚无明确的研究结论。本实验通过检测自噬相关蛋白BECLIN l、LC3-II的表达变化，观察自噬和溶酶体的激活以及细胞超微结构的变化，探讨自噬在缺血预处理保护作用中的影响，为临床治疗积累更多的理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组： 健康成年雄性SD大鼠50只，体质量(250±50)g，清洁级，由河北联合大学实验动物中心提供，喂养条件如下：5只1笼，室温22℃，湿度50%～60%，通风良好，自由摄食摄水，常规普通饲料喂养。随机分为3组：假手术组(Sham 组，n=10)、缺血再灌注组(I/R 组，n=10)、缺血预处理组(IPC 组，n=30)，IPC组按照缺血预处理1 d、3 d、5 d分为3个亚组(n=10)。

1.1.2 实验材料： 兔抗鼠BECLIN l抗体(bs-1353R，北京博奥森生物技术有限公司)；兔抗鼠LC3-II抗体(bs-4843R，北京博奥森生物技术有限公司)；羊抗兔二抗工作液(SP-9002，中杉金桥)；H-600型透射电镜；切片机(瑞典LKB公司)；37℃低温烘箱。

1.2 模型制备 参照Zea-Longa线栓法[1]制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。大鼠术前禁食12 h，10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，固定头部及四肢，碘伏消毒皮肤，取颈正中皮肤切口，分离皮下组织及肌肉，暴露右侧颈总动脉，分离迷走神经，暴露右侧颈外动脉和颈内动脉，结扎颈外动脉和颈总动脉，在颈总动脉近分叉处剪一小口，插入0.26～0.30 mm线栓，前进约18～20 mm有阻力感为止，留1 cm线栓在皮肤外，缝合肌肉和皮层，酒精消毒皮肤，术中保持大鼠直肠温36～37℃。Sham组不插线栓，余操作相同；I/R组缺血2 h、再灌注24 h；IPC组缺血10 min、再灌注10 min，反复3次，完成预处理，分别维持灌注1 d、3 d、5 d，再次缺血2 h、再灌注24 h。

1.3 观测指标

1.3.1 神经功能障碍评分： 参照Zea-Longa神经功能障碍评分[1]。0分，无明显神经功能障碍；1分，不能完全伸展左前肢；2分，爬行时向左侧转圈；3分，爬行时向左侧倾倒；4分，无自主活动能力。

1.3.2 氯化三苯基四氮(TTC)染色： 各组随机选取3只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，快速取脑，-20℃放置10 min，冠状面均匀切片，2%TTC溶液37℃避光染色30 min，每隔7～8 min用眼科镊翻转1次，4%多聚甲醛固定24 h，数码相机拍照，输入计算机，图像分析软件计算脑梗死体积(红色区为正常脑组织，白色区为梗死脑组织)百分比，即梗死脑组织体积占对侧正常脑组织体积百分比。

1.3.3 免疫组织化学染色： 各组随机选取4只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉，经左心室先后以生理盐水和4%多聚甲醛灌注固定，取视交叉后1～5 mm处脑组织，4%多聚甲醛固定24 h以上，常规石蜡包埋，做5 μm连续切片备用。切片常规脱蜡至水；3%H2O2室温避光10 min灭活内源性过氧化物酶；微波或高压修复抗原；滴加兔抗鼠BECLIN 1、LC3-II抗体，工作浓度1∶50，4℃过夜；复温后滴加羊抗兔二抗工作液，37℃ 1 h；DAB显色8～12 min；苏木素复染2～3 min，分化后充分蓝化，脱水透明封片。各步骤之间用PBS缓冲液洗5 min×3次。用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。结果判定及计数：BECLIN l、LC3-II阳性细胞胞浆呈棕黄色，核呈蓝色；每只动物选取4张切片，光学显微镜高倍镜(×400)视野下，每张切片观察5个视野，计数阳性细胞，取均值。

1.3.4 电镜标本制作： 各组随机选取3只大鼠，10%水合氯醛深度麻醉，快速断头取脑，分离右侧海马组织(冰上操作)，取大小约1 mm3组织块，迅速置入预冷的4%戊二醛溶液中，4℃保存固定24 h以上，1%锇酸后固定，丙酮逐级脱水，树脂包埋，切片机切片，枸橼酸铅染色，透射电镜观察自噬体、溶酶体及细胞超微结构。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量数据以均数±标准差表示，以单因素方差分析进行多组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。2结果

2.1 神经功能障碍评分 Sham组未出现神经功能障碍，I/R组及IPC组均出现不同程度神经功能障碍(P<0.01)，IPC组神经功能障碍评分明显低于I/R组(P<0.05)，IPC各亚组间比较未见显著性差异(P>0.05)。见表1。

2.2 脑梗死体积计算 Sham组无肉眼可见的梗死灶；I/R组及IPC组均有不同程度梗死灶(P<0.01)；IPC组脑梗死灶体积明显低于I/R组(P<0.01)，IPC 3 d亚组和1 d、5 d亚组间脑梗死灶体积差异有显著性意义(P<0.01)，1 d和5 d亚组间脑梗死灶体积差异无显著性意义(P>0.05)。见表1。

表1 5组再灌注24 h神经功能障碍评分、脑梗死体积百分比比较

注：与Sham组比较，aP<0.01；与I/R组比较，bP<0.05，cP<0.01；与1 d、5 d亚组比较，dP<0.01

2.3 免疫组织化学染色 Sham组只见少量BECLIN l及 LC3-II阳性细胞；I/R组及IPC组均可见大量BECLIN l及 LC3-II阳性细胞(P<0.01)，IPC组BECLIN l及 LC3-II阳性细胞表达显著低于I/R组(P<0.01)，3 d亚组和1 d、5 d亚组间BECLIN l及LC3-II阳性细胞表达差异有显著性意义(P<0.01)，1 d和5 d亚组间BECLIN l及LC3-II阳性细胞表达差异无显著性意义(P>0.05)。见表2，图1、2见封3。

表2 5组再灌注24 h BECLIN 1、LC3-II阳性细胞数的比较个/HP)

注：与Sham组比较，aP<0.01；与I/R组比较，bP<0.01；与1 d、5 d亚组比较，cP<0.01

2.4 脑组织超微病理形态改变 Sham组细胞核膜完整，染色质分布均匀，各种细胞器形态正常，无自噬体出现；I/R组及IPC组可见数量不等、处于不同时期的自噬体和或自噬溶酶体，线粒体肿胀，膜破裂，可见空泡，各级溶酶体显著增多，可见变形次级溶酶体，高尔基体分裂；IPC组自噬体及各级溶酶体数量较I/R组减少，各IPC亚组间自噬体及各级溶酶体数量无可见变化。图3见封3。

3 讨 论

脑缺血预处理又称脑缺血耐受，是指在长时间缺血再灌注之前，给予一次或多次短暂缺血再灌注，使机体产生缺血耐受。1990年，Kitagawa等发现了脑缺血耐受现象，从此许多学者开始研究其分子生物学机制，试图从中发现新的神经保护途径。究竟脑缺血耐受现象是如何产生的，关键是给予适宜的缺血预处理时间和缺血耐受诱导时间。除单循环缺血预处理之外，短时间缺血、复以短时间再灌注，多循环预处理方式，可以发挥更好的保护作用。缺血预处理对组织或器官的保护作用具有时效性，然而这种时效性由于实验对象、实验模型及缺血预处理方案的不同，有不同的研究结论[2，3]。本实验采取缺血10 min/再灌注10 min反复3次，分别间隔1 d、3 d、5 d再次实施缺血再灌注的预处理方案，结果显示：与Sham组相比，I/R组大鼠出现显著神经功能障碍及脑梗死(P<0.01)，与I/R组比较，IPC组大鼠神经功能障碍评分明显减低(P<0.05，P<0.01)，脑梗死体积明显缩小(P<0.01)，IPC-3d亚组大鼠脑梗死体积最小(P<0.01)。

细胞通过溶酶体途径降解衰亡的细胞器及损伤的蛋白即是自噬[4]。适量自噬可使细胞完成自身代谢和细胞器更新，而过量自噬则会造成细胞死亡增多，从而导致病理变化在组织或器官中产生。自噬可被缺血再灌注激活，但自噬究竟是保护细胞还是加速细胞死亡，目前观点尚未统一，可能取决于疾病发展的不同阶段。哺乳动物细胞中酵母自噬相关基因 6(Atg6)的同源基因即为BECLIN 1，其对自噬体膜的形成起作用[5]，BECLIN 1被激活可开启细胞自噬程序，促进自噬溶酶体形成，是自噬启动的标志，BECLIN 1表达过多可促进自噬发生[6]。哺乳动物细胞中酵母自噬相关基因8(Atg8)的同源基因即为LC3，其有I型和II型之分，LC3-I和磷脂酰乙醇胺(PE)结合即可形成LC3-II，其对自噬体的形成具有重要作用，可认为是自噬体形成的标志[7，8]。透射电镜可准确观察自噬体形成的不同阶段，可见在受损细胞器周围出现C字型或口杯形双层膜结构，其延长将受损细胞器包绕，形成自噬体，后被转运至溶酶体，溶酶体将其吞入，形成自噬溶酶体，再将受损细胞器降解。本实验结果显示：与Sham组相比，I/R组BECLIN l、LC3-II阳性细胞表达增多显著(P<0.01)，可见自噬体和或自噬溶酶体，与I/R组相比，IPC组BECLIN l、LC3-II阳性细胞表达及自噬体和/或自噬溶酶体数量明显减少(P<0.01)，IPC 3 d亚组BECLIN l、LC3-II阳性细胞表达最少(P<0.01)。

综上所述，缺血再灌注使神经细胞发生损伤，并激活自噬，缺血预处理使BECLIN l、LC3-II蛋白表达下调产生神经保护作用，并且预处理后3 d作用最强。自噬与缺血预处理的神经保护作用的确切机制及其所涉及的调控因子，尚需要更多的实验研究来阐明。

1 胡跃强，唐农，董少龙，等．大鼠局灶性脑缺血预处理后caspase-12mRNA及其蛋白的表达变化[J]．广东医学，2012，33(6)：739-741．

2 刘树峰，尹文，虎晓岷.亚低温联合依达拉奉对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].疑难病杂志，2013，12(2)：126.

3 田军彪，赵见文，张颜伟，等.脑缺血再灌注损伤的中医药实验研究进展[J].疑难病杂志，2011，10(6)：477.

4 董琳，童煜，毛萌．PC12细胞氧糖剥夺/再灌注损伤中自噬与凋亡现象[J]．实用儿科临床杂志，2012，27(18)：1397-1401．

5 张蕾，刘卫红，解欣然，等．参元丹含药血清对心肌缺血保护作用及其微管相关蛋白及自噬相关基因表达的影响[J]．辽宁中医药大学学报，2012，14(8)：109-113．

6 常健，何斌，朱晓燕，等．缺血再灌注损伤诱导心肌细胞自噬相关基因过表达[J]．第二军医大学学报，2011，32(7)：776-778．

7 苏方，张培，姜治伟，等．海马神经元缺血/再灌注后自噬的表达及其作用[J]．中国应用生理学杂志，2011，27(2)：187-191．

8 曾斌，王静文，张玉琳，等．自噬标志性分子LC3B在大鼠全脑缺血复灌损伤中海马CA1区的表达及意义[J]．中国临床解剖学杂志，2012，30(6)：667-669．

Influencesofischemicpreconditioningonautophagyinratswithcerebralischemiareperfusioninjury

SHIQiuyan,LIUBing,ZHANGChunyang,FANYaxia，SUNYuan，YANGBin.

DepartmentofNeurology,AffiliatedHospitalofHebeiUnitedUniversity,Tangshan063000,China

ObjectiveTo observe the effect of ischemic preconditioning(IPC) effect on cerebral ischemia reperfusion in rat hippocampus of autophagy.MethodsAccording to method of Zea-Longa filamene, rats middle cerebral artery ischemia-reperfusion model were established, the experimental animal were randomly divided into 3 groups: sham operation group (Sham group,n=10), ischemia reperfusion group (I/R group,n=10), IPC treatment group (IPC group,n=30), in IPC group, according to ischemic preconditioning time, rats were divided into 1 d, 3 d, 5 d subgroups, 10 rats in each group. After ischemia 2 h and reperfusion 24 h, immunohistochemical method was used to detect the autophagy associated protein BECLIN L, LC3-II expression, transmission electron microscope in nerve cell autophagy and lysosomal activation and cell ultrastructure changes.Results(1) Neurological dysfunction score: compared with Sham group, I/R group and IPC group showed varying degrees of nerve dysfunction (P<0.01), I/R group of symptoms in IPC subgroups (P<0.05). (2) The volume of cerebral infarction: compared with Sham group, I/R group and IPC group had different degree of infarction (P<0.01); IPC group was lower than that in I/R group (P<0.01), 3 d subgroup was less than 1 d and 5 d subgroup (P<0.01). (3) Immunohistochemical staining: compared with Sham group, I/R group and IPC group, the number of BECLIN 1 and LC3-II positive cells (P< 0.01), the expression of IPC positive cells was significantly lower than that of I/R group (P< 0.01), IPC 3 d subgroup was less than 1 d, 5 d subgroup (P< 0.01). (4) The change of brain tissue ultrastructure morphology of cells:Sham group was normal; I/R group and IPC group showed varying amounts of autophagy, in different period and or autophagic lysosome, mitochondria swelling, rupture of membranes, vesicles, lysosomes increased significantly,visi-ble deformation of secondary lysosomes,Golgi fragmentation;IPC group autophagy and the number of lysosomes was significantly reduced compared with I/R, the number of the IPC between the subgroups of autophagosomes and lysosomes revealed no visible change.ConclusionIPC may inhibit autophagy relieve the ischemic reperfusion injury,3 d IPC is better than 1 d, 5 d.

Autophagy; Ischemic preconditioning; Ischemia reperfusion injury; BECLIN 1; LC3-II

063000 唐山，河北联合大学附属医院神经内科

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.07.019

2014-02-18)