郑延红， 杨娜娜， 夏作理

(1兵器工业北京北方医院，北京 100089； 2泰山医学院生命科学研究所，山东 泰安 271000)

水通道蛋白 4(aquaporin 4，AQP4)在哺乳动物脑内广泛分布，主要存在于与血脑屏障相关的毛细血管内皮细胞及其相连的胶质细胞，其次是脑室室管膜上皮细胞、脑室脉络丛上皮细胞和下丘脑神经元[1]，脑干神经核团和大脑皮质部分神经元也有分布，其表达远比AQP1和AQP9表达丰富，并且其高度快速转运水的能力比其它的水通道蛋白对水的通透性高3～4倍，在脑内担负着水代谢平衡的调节和神经兴奋性的保持作用[2]。AQP4不仅参与了细菌性脑膜炎和脑缺血早期、脑出血及脑创伤后等的细胞毒性脑水肿的形成[3]，而且加快脑肿瘤、脑出血、创伤等形成的血管性脑水肿的消散[4]。然而，在淋巴性脑水肿(lymphatic brain edema，LBE)形成和消散机制中，AQP4的地位尚不明确。为此，本实验目的旨在研究LBE脑含水量与AQP4表达的关系，以明确AQP4在LBE中的作用。

材 料 和 方 法

1 动物及分组

选用健康、雄性Sprague-Dawley大鼠(山东大学动物实验中心提供)，体质量(246±44)g，平均268 g，随机分为假手术组(sham组)和淋巴性脑水肿组(LBE组)。各取90只大鼠分别制作LBE动物模型和假手术，每组于相应手术后第1、3、7、11及15天取大脑皮质，分别进行脑含水量、AQP4免疫荧光组织化学及免疫印迹蛋白表达的检测。

2 动物模型及标本的制备

2.1动物模型的制备 按照改良的Casley-Smith方法[5]，以盐酸氯胺酮50 mg/kg和地西泮5 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。固定后，颈部手术区剪毛，常规消毒、切开皮肤，分离皮肤及皮下组织，分别暴露双侧颈浅、颈深淋巴结及相应淋巴管，结扎淋巴管并摘除淋巴结，然后逐层缝合。模型成功的判断标准：术后出现明显的行为改变，颈部切口无渗出、肿胀及感染，显微镜下有典型的脑水肿征象为模型制作成功。假手术组步骤同模型组，但不结扎淋巴管，亦不摘除相应的淋巴结。

2.2标本的制备 每个时点各取6只大鼠，深麻醉大鼠，0.1 mol/L PBS (pH 7.4) 经心灌注，然后断头处死，冷环境条件下迅速取脑，分取右侧大脑皮层组织120 mg左右称重，进行脑含水量测定。左侧大脑皮层组织留取标本，进行免疫印迹蛋白表达的检测。另各取3只大鼠，先用37 ℃肝素化生理盐水(含肝素5 000 IU)100 mL冲净血液，然后缓慢灌注4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(4 ℃ pH 7.4)300～400 mL，开颅取大脑皮层组织，后固定24 h。放入20%、30%蔗糖梯度脱水，待脑组织下沉后，-20 ℃ 低温冠状面冰冻切片备用。每10张取2张，片厚6 μm，取2套切片，1套行AQP4免疫荧光组织化学染色，另1套作为阴性对照。

3 主要方法

3.1脑含水量测定 按干-湿重法测定大脑皮层组织含水量：将取出的大脑皮层组织标本，迅速称湿重，然后放置于高温干燥箱内，105 ℃，干燥48 h后，称量得到干重。脑组织脑含水量按Elliott公式计算：脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

3.2免疫荧光组织化学染色法 切片放入0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2～7.4)漂洗3次，每次5 min。漂洗后放入10%羊血清中，37℃孵育1 h。将切片放入稀释后的兔抗大鼠AQP4Ⅰ抗(1∶100，Santa Cruz)中，移入4 ℃冰箱孵育过夜。PBS漂洗3次，每次5 min，切片滴加荧光素FITC标记的山羊抗兔Ⅱ抗(1∶100，Santa Cruz)，37℃孵育1 h。PBS漂洗3次，每次5 min。封片，应用Radiance 2100 型荧光扫描共聚焦显微镜观察，Image-Pro Plus图像分析系统分析荧光强度值。每个标本染3张切片，每张随机取5个视野(×400倍)的图像。阴性对照不加AQP4Ⅰ抗，代之以PBS。结果判定：AQP4阳性表达为胞膜及胞浆内出现绿色荧光信号。随机选取5个视野的图像，应用Image-Pro Plus软件计数荧光阳性表达数，并计算每只大鼠的平均荧光强度。

3.3Western blotting 按照RIPA试剂盒快速提取蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，10% Tris-glycine SDS-PAGE，湿转将蛋白条带转移至 PVDF膜上，Western blotting 封闭液室温封闭1 h; 加兔抗大鼠AQP4(1∶1 000，Santa Cruz)，4 ℃过夜；加碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG(1∶2 500，Sigma)，室温孵育2 h，BCIP/NBT显色，使用Quantity One 软件进行半定量分析，结果以目的蛋白和β-actin 吸光度的比值表示。

4 统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示。多组样本均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 脑含水量的变化

在LBE组，大鼠大脑皮质含水量呈先增加后降低的趋势，术后第3天开始上升(P<0.05)，第7天达到峰值(P<0.01)，第15天仍高于假手术组水平(P<0.05)，见图1。

Figure 1. Changes of the cerebral cortex water content in rats with LBE. Mean±SD.n=6. *P<0.05,**P<0.01 vs sham.

2 AQP4免疫荧光组织化学表达的变化

Sham组大鼠的大脑皮质可见AQP4免疫荧光染色阳性神经胶质细胞足突及血管周围少量分布，LBE后3 d即见阳性细胞数目增多，免疫荧光染色强度增高(P<0.05)，至7 d阳性细胞数目最多，且染色强度最高(P<0.01)，以后逐渐减少，15 d未恢复至正常，见图2。

Figure 2. Laser confocal microscopy of AQP4-immunofluorescence,intensity and cell number in cerebral cortex of rats with LBE. Scale bar=50 μm.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs sham.

3 AQP4蛋白表达的变化

Sham组大鼠的大脑皮质可见AQP4蛋白微弱表达，LBE后3 d AQP4表达增加(P<0.05)，7 d达到峰值(P<0.01)，15 d仍高于假手术组水平(P<0.05)，见图3。

4 淋巴性脑水肿大脑皮质含水量与AQP4蛋白表达的相关性

大脑皮质含水量和AQP4蛋白表达均呈正相关关系(r=0.8024，P<0.05)。

讨 论

脑水肿是指脑组织含水量增加引起脑容积的扩张，为中枢神经系统对各种原因的脑损害产生的一种组织病理反应，是各种脑部疾病的严重并发症。

Figure 3. Changes of AQP4 expression in cerebral cortex in rats with LBE (Western blotting). Mean±SD. n=6.*P<0.05,**P<0.01 vs sham.

按其发生机制又分为细胞毒性水肿和血管源性水肿[6]，主要与细胞膜能量代谢障碍、脑微循环障碍及血脑屏障(blood brain barrier，BBB)、自由基、钙超载、兴奋性氨基酸的毒性作用、一氧化氮、内皮素等因素有关[7]，但确切机制尚不明确。近年来随着分子的研究深入，AQP4日益成为脑水肿研究的热点。AQP4 主要存在于脑星形胶质细胞、毛细血管内皮细胞、室管膜上皮细胞、邻近软脑膜的胶质细胞及脉络丛上皮细胞中，覆盖超过95%的脑毛细血管表面[8]，并且AQP4 在大脑的大量分布，以及在星形胶质细胞上的分布呈明显的极性，即在靠近血管内皮细胞的星形胶质细胞终足上大量表达[9]，因而成为胶质细胞与脑脊液及血管之间水转运和调节的重要结构基础，在维持脑内水平衡中发挥重要作用。

组织病理及超微结构观察显示[10],LBE时脑组织明显水肿，并有红细胞溢出以及吞噬细胞浸润，脑的小动脉外膜出现半月形或不规则形间隙，其间充满水肿液，形成脑间质水肿，为血管源性水肿。同时，水肿区脑组织出现慢性进行性缺血、缺氧及酸中毒等病理过程，进而使细胞间正常的物质及信号传递障碍，细胞代射紊乱，神经细胞膜ATP合成减少，钠钾泵失调使细胞内高渗，细胞内外的渗透压变化可能通过上调AQP4 表达加速水分流入，形成细胞毒性脑水肿[11]。最终形成血管源性水肿和细胞毒性水肿并存的混合性水肿，许多情况下难于明确区分。

本实验中，与sham组相比，LBE模型大鼠大脑皮质AQP4免疫荧光及蛋白的表达水平明显增加，均以术后7 d水平最高，后逐渐降低，15 d时仍高于sham组，脑含水量的变化趋势与之相一致，且脑含水量与AQP4蛋白表达呈正相关关系，提示AQP4参与脑水肿时脑组织水分布的变化，同时AQP4介导的跨细胞膜水的转移为血管性脑水肿液体清除的关键[12]。LBE时乳酸中毒、钠钾泵和钙失衡以及渗透压变化为细胞性水肿的主要原因[13]，AQP4为水跨星形胶质细胞运输的主要路经，通过AQP4参与水大量而快速通过细胞膜，导致星形胶质细胞和神经元肿胀[9]和BBB的破坏。我们推断，缺血缺氧能够诱导星形胶质细胞AQP4蛋白活性部分得到激活，水大量而快速通过细胞膜，以降低细胞内外的渗透压梯度，使渗透性物质进一步流入胶质细胞，导致细胞体积的增大，AQP4在促进水分进入星形胶质细胞中起着重要作用[14]，因此早期AQP4表达增高是胶质细胞的适应性反应。血管源性脑水肿的水肿液清除主要通过细胞外间隙和胶质细胞界膜至脑室和蛛网膜下腔，另外还通过胶质细胞终足和毛细血管内皮细胞入血[15]，而AQP4正是在大脑这些区域大量表达，AQP4 的开放和表达升高有利于加速水肿的消退，可在一定程度减轻血管源性脑水肿。由于LBE为细胞性和血管源性水肿共同存在，因此AQP4的表达升高，不仅参与了脑水肿的形成，也有助于LBE的吸收与恢复。

我们推测，LBE后出现能量代谢障碍，初期细胞缺氧引起细胞毒性水肿，随之而来的是血管源性水肿，并且在7 d达到高峰，以后逐渐减轻。细胞毒性水肿阶段AQP4逐渐升高，说明脑水肿越重，神经元的破坏越明显，血管性水肿时AQP4显著表达，以加快脑水肿的清除。AQP4在星形胶质细胞介导水的运输，跨过BBB交界面对水分子的流向起着双向调节作用[1]，因此AQP4在LBE后脑水肿的形成和消除中发挥了重要的作用。

[参 考 文 献]

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