张青森， 杨庆帆， 陈白莉， 何 瑶， 陈旻湖， 曾志荣

(中山大学附属第一医院消化内科, 广东 广州 510080)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种病因尚不清楚的慢性非特异性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn disease，CD)。近年来，炎症性肠病的发病率明显上升[1-2]。然而，其发病机制仍未明确，目前认为是由遗传、环境和免疫等多因素共同作用所致。

白细胞介素33(interleukin-33，IL-33)是新近发现的炎症因子，具有抑制和促进炎症的双重作用[3-4]，与多种免疫及过敏性疾病相关[5-6]。研究发现，其在IBD患者肠、黏膜和血清中明显异常表达[7-8]，并在IBD炎症、黏膜愈合及纤维化等方面发挥重要作用[9]。Latiano等[10]近期发现IL-33基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP) rs3939286增加意大利人IBD发病风险，而关于IL-33基因多态性与中国人群IBD的关系尚无报道，本研究旨在探讨IL-33基因单核苷酸多态性与中国南方人群IBD发病及临床表型间关系。

材 料 和 方 法

1 研究对象

将我院 2003年～2012年IBD诊治中心确诊的365例IBD患者 (CD 250例，UC 115例)，以及同期在我院健康体检的622名性别、年龄匹配的健康人(无免疫系统相关病史)纳入本研究。IBD诊断标准参考2012年中华医学会消化病学分会推荐标准[11]，基于临床表现、消化内镜及组织学检查作出临床诊断，确诊病例为经病情观察符合CD/UC病程经过或通过手术取得病理诊断者。临床资料通过查阅我中心IBD数据库获得，包括患者人口学资料及临床分型特征，即性别、发病年龄、症状、吸烟史、家族史、肠外表现、肛周病变、临床特征等，IBD临床分型采用蒙特利尔分型标准[12]，见表1。本研究已通过中山大学附属第一医院临床研究伦理委员会批准，标本采集获得研究对象的知情同意。

表1 炎症性肠病病人基本资料

2 方法

2.1基因组DNA获取 采集患者及健康对照每人2 mL外周血，利用天根血液基因组织DNA 提取试剂盒 (北京天根有限公司) 提取基因组DNA。操作步骤参见试剂盒说明书。

2.2SNP挑选及分型检测 本研究选择的8个标签SNP(Tag-SNP)是综合考虑已有文献对于IL-33与疾病关系的报道以及SNP位点在IL-33基因的具体位置而确定的，前者基于IBD与多种免疫相关疾病存在基因重叠，后者基于突变点是否可能影响IL-33的表达及功能(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?chooseRs=doublehit&locusId=90865&mrna=NM_001199640.1&ctg=NT_008413.18&prot=NP_001186569.1&orien=forward&refresh=refresh)。各位点的功能特性、最小等位基因频率及与疾病的关系情况见表2。SNP检测采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)，由深圳华大基因有限公司完成。

表2 8个SNP的基本信息

2.3相关评判标准 内镜下黏膜愈合情况依据CDEIS评分分为愈合、部分愈合和未愈合3个等级；愈合定义为CDEIS评分<3分和(或)内镜下未见溃疡；部分愈合定义为CDEIS评分3～6分和(或)内镜下肠道黏膜轻度炎症、小糜烂、浅溃疡或者溃疡较前好转；无效定义为CDEIS评分较前下降<5分，溃疡仍然存在，较前无明显消失或者变浅[11,13]。英夫利昔单抗临床疗效评估依据CDAI[11]，临床有效定义为CDAI下降≥70分，临床缓解定义为CDAI下降虽<70分但CDAI<150分，临床无效为使用英夫利昔单抗治疗10周时患者临床症状未改善且CDAI评分>150分。

3 统计学处理

应用SPSS 13.0统计软件分析。根据Hardy-Weinberg遗传平衡定律，采用2检验分析CD、UC及对照组样本的群体代表性。各SNP位点在病例组与对照组基因型及等位基因分布频率的比较采用 Pearson2检验；基因型及等位基因与IBD临床特征间关系采用单因素和Logistic回归分析，计算优势比(odds ratio，OR)及其95%置信区间(confidence interval，CI)，其中OR值经性别和年龄校正。数据以均数±标准差(mean±SD)表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 一般情况

本研究病例组共纳入365例IBD患者，均为中国南方汉族人(表1)，其中CD 250例，UC 115例。CD患者平均年龄(32.7±12.3)岁，其中男性160(64.0%)例；UC患者平均年龄(38.0±13.6)岁，男性共68(87.0%)例。对照组共622名，平均年龄(31.4±8.0)岁，男性400(64.3%)例。CD及UC组与对照组间的性别和年龄构成比均无显著差异(P>0.05)。

2 IL-33各SNPs基因型在IBD患者及健康人群中的分布

挑选的8个SNP在CD、UC及对照组中基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，具有群体代表性。进一步分析比较发现，这8个SNP位点的基因型及等位基因频率在病例及对照组中均无显著差异(P>0.05),见表3。

表3 各SNP的基因型在CD、UC及对照组中频数及频率分布情况

3 IL-33各SNPs基因型与IBD临床表型的关系

rs10118795和rs7025417的基因型与CD患者肠外表现相关。rs10118795 含等位基因T的基因型(包括CT和TT)是肠外表现的保护因素(P<0.05, OR=0.513, 95% CI： 0.281～0.938)，见表4；而rs7025417 CC基因型的CD患者出现肠外表现的风险更高(P<0.05, OR=1.363, 95% CI： 1.006～1.846),见表5。

表4 rs10118795基因型与CD临床特征的相关性

表5 rs7025417基因型与CD临床特征的相关性

rs10118795及 rs10975519与CD患者肛周病变相关，而rs10975509跟CD患者初诊时病变部位相关。rs10118795 含C等位基因的基因型(CC和CT)降低肛周病变风险(P<0.05, OR=0.480, 95% CI： 0.232～0.994),见表4；而rs10975519野生纯和子CC显著增加肛周病变风险(P<0.05, OR=2.054，95% CI： 1.053～4.009),见表6。对于rs10975509，其与上消化道型CD高度相关，含G等位基因的基因型(GA和GG)增加上消化道型CD风险(P<0.05, OR=3.570, 95% CI： 1.328～9.600)，同时该SNP 的A等位基因是回结肠型CD(P<0.05, OR=0.613, 95% CI： 0.377～0.996)的保护因素,见表7。

表6 rs10975519基因型与CD临床特征的相关性

表7 rs10975509基因型与CD临床特征的相关性

在SNP与英夫利昔单抗治疗疗效关系分析中，共纳入29名长期行英夫利昔单抗治疗CD患者，我们分析了8个SNP位点基因型与10周、30周内镜黏膜愈合情况及临床疗效的关系。rs10118795、rs10975509和rs7025417基因型与英夫利昔单抗治疗后CD患者30周黏膜愈合相关(分别为P<0.05、P<0.01和P<0.05),见表8，但进一步分析未能明确某一个基因是30周黏膜愈合的危险或者保护因素。8个SNP与英夫利昔单抗治疗临床疗效无关。

表8 SNP与CD患者英夫利昔单抗治疗30周黏膜愈合情况的相关性

同时，对这8个SNPs与UC发病及临床表型的关系的分析未发现相关性(P>0.05)。

讨 论

IBD作为一种发病率逐年增加的肠道非特异性炎症性疾病，其发病机制目前尚不清楚，研究表明遗传、免疫、环境等多种因素参与到IBD发病中。在遗传方面， IBD国际基因协作组通过GWAs及基因芯片技术已经发现有关IBD的163个基因位点[14]，尽管如此，仍有约30%常见变异型未被包括在内。许多研究显示，炎症因子及其受体基因的SNP与IBD疾病易感性相关，例如很多IL-1家族成员，如IL-1β[15]、IL-1RA[16]、IL-18等[17]，它们的基因SNPs均与IBD疾病易感性相关。IL-33是IL-1家族的新成员。研究发现，其对炎症具有双向调节作用：一方面，可进入核内抑制基因转录[3]，最终抑制炎症信号通路；另一方面，可通过与跨膜ST2(ST2L，需IL-1RAcP辅助)[4]作用激活炎症通路，从而促进肠道炎症；此外，IL-33还可促进IBD炎症慢性转化并参与肠黏膜愈合、上皮修复及纤维化过程[18]。

本研究选择了IL-33基因的8个SNP位点，研究其与中国南方汉人IBD间的关系。数据分析结果显示，这8个SNP位点并不增加IBD发病风险，但我们发现rs10118795、rs7025417、rs10975509和rs10975519影响CD的临床表型。

rs10118795、rs7025417和rs10975509均位于转录因子结合位点(transcription factor binding site，TFBS)，TFBS是与转录因子结合的DNA序列，它们与转录因子相互作用调控基因的转录过程，因此这些位点的变异可能影响IL-33的表达，从而影响疾病表型。我们研究首次发现这3个SNP位点与CD相关。rs10118795 T等位基因是肠外表现的保护因素，且C等位基因携带者出现肛周病变的风险降低；而在rs7025417，携带基因型CC的CD患者出现肠外表现的风险更高；rs10975509则与CD病变部位相关，AA基因型的患者出现上消化道型CD风险更高，同时数据显示该SNP GG基因型增加出现回结肠型CD的风险。最后，我们还发现这3个SNP的基因型与英夫利昔单抗治疗后CD患者30周黏膜愈合相关，但进一步分析未发现哪一个基因是30周黏膜愈合的危险或者保护因素，可能是样本量不足所致。

rs10975519和rs1929992在日本人花粉症中有报道[19]，前者与花粉症发病无关，而后者CC型基因增加该病发病风险。本研究并未发现rs1929992与中国IBD发病及临床表型相关，但rs10975519 CC型增加CD患者出现肛周病变机会，据报道[19]rs10975519位于IL-33基因外显子区域，可出现错意突变，并与周围碱基形成剪切增强子或剪切沉默子，由此可能影响IL-33的表达水平或者mRNA稳定性。

rs11792633和rs7044343均为内含子，前者与汉人及白种人阿尔兹海默病发病相关，其T等位基因为该疾病的保护性因素，而后者只与白种人阿尔兹海默病发病相关[20]，但本研究未发现它们在IBD中的作用。

由于这8个SNP位点存在高度连锁不平衡，所以未进一步做单体型分析。另外，本研究中纳入进行IL-33 SNP与英夫利昔单抗治疗疗效关系分析的样本数目过少，因此，它们之间的具体关系有待继续论证。

IBD的遗传背景十分复杂，作为一种多基因疾病，不同的人种、国家甚至地区间均存在遗传易感性差异，本研究分析了IL-33与中国南方汉人IBD遗传易感性的相关性，发现了与中国南方人群相关的tSNPs，其中rs7025417跟CD临床表型相关，然而Latiano等[10]研究表明，rs7025417跟意大利IBD的发病及临床表型均无关，这进一步说明不同种族存在着遗传易感性差异；此外，IL-33与其他人群的关系有待进一步研究，以便全面认识IL-33与IBD的关系。IL-33基因多态性与其表达是否相关，其多态性参与调节IBD疾病进展的具体机制仍有待研究。

[参 考 文 献]

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