王 哲， 刘晓玉， 张殿宝， 王秋实△

(1中国医科大学盛京医院输血科，辽宁 沈阳 110004； 2中国医科大学细胞生物学卫生部重点实验室，干细胞与再生医学研究室，辽宁 沈阳 110001)

糖尿病动物和病人血中晚期糖基化终产物(advanced glycosylation end products，AGEs)含量明显升高，并伴有间充质干细胞功能的损伤[1-2]。人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived stem cells，hADSCs)是一种来源于脂肪组织的间充质干细胞，动物和临床试验均已经证实hADSCs对糖尿病患者皮肤溃疡愈合有明显的促进作用[3]。hADSCs一方面通过自身的增殖、迁移和分化来修复创面；另一方面通过分泌多种生长因子，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)等来调节创面周围细胞功能[4-5]。尽管自体hADSCs治疗皮肤溃疡取得了很好的效果，但是一些研究中仍然发现由于hADSCs功能损伤导致糖尿病患者皮肤溃疡愈合不良[6-7]。本研究拟用含晚期糖基化终产物修饰的牛血清白蛋白(advanced glycosylation end product-bovine serum albumin，AGE-BSA)的培养基对hADSCs培养，通过对干细胞增殖和迁移能力及多种生长因子的检测，探讨AGEs对hADSCs生物学功能的影响，为临床上提高自体干细胞移植治疗糖尿病皮肤溃疡后供体干细胞的功能提供新的依据。

材 料 和 方 法

1 主要材料与试剂

中国医科大学附属盛京医院整形外科在无菌条件下取健康成人脂肪组织(经医院伦理委员会许可和患者同意)100 g；胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco)；FITC 标记的抗CD34、CD45、CD90和CD105抗体(BD)；小牛血清白蛋白和葡萄糖(Sigma)；人纤维连接蛋白 (Roche)；人间充质干细胞培养基以及成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞诱导分化培养基 (Stem Cell Technology)；WST细胞生长检测试剂盒(日本株氏会社同仁化学研究所)；生长因子检测试剂盒(R&D)。

2 方法

2.1hADSCs分离与培养 除血管、筋膜的脂肪组织置于平皿中，PBS洗3次后剪碎，加入2倍体积胶原蛋白酶Ⅰ，37 ℃消化60 min，终止消化后于细胞筛上过滤，1 500 r/min离心5 min收集细胞后以2×108/L的浓度接种于培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，记为P0。根据细胞贴壁情况，1～2 d全量换液1次。待细胞增殖达80%～90%时，按1∶3的比例传代记为P1。

2.2hADSCs的鉴定 流式细胞术检测 FITC 标记的间充质干细胞表面标志物CD105、CD90、CD34、CD45 等特异性抗体。

2.3诱导hADSCs向成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞分化及鉴定 诱导第3代分离培养的hADSCs向成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞分化，培养21 d 后进行鉴定，具体方法参照文献[8-9]。

2.4AGE-BSA的制备与分组 将小牛血清白蛋白50 g/L与0.5 mmol/L葡萄糖溶于磷酸盐缓冲液中，室温放置过夜，对照组中不含葡萄糖，其余条件一致。过滤除菌后置37 ℃避光孵育3个月。实验前置于透析膜中，去除未结合的葡萄糖。荧光光谱扫描检测AGE-BSA。将第3代贴壁培养的hADSCs分为BSA对照组、低浓度(50 mg/L)AGE-BSA作用组和高浓度(100 mg/L)AGE-BSA作用组。

2.5增殖能力检测(WST法) 各实验组分12 h、1 d、2 d、3 d和4 d时点进行增殖能力检测。实验终止前2 h向各组细胞 每孔中加入CKK-8 试剂20 μL, 培养结束时以酶标仪检测吸光度 (A450值)。

2.6迁移能力检测 各实验组12 h、24 h和36 h时点进行迁移能力检测。将 25 μL培养液和AGE-BSA (50 mg/L或100 mg/L) 加入改良的 Boyden Chamber 的下室，盖上滤膜和趋化小室的上室；将含 2×104个hADSCs 50 μL 培养液注入上室， 盖以载玻片；放入培养箱中培养 24 h；刮去滤膜上面的未移动细胞，用 4%多聚甲醛固定滤膜，Giemsa 染色，蒸馏水冲洗，干后镜检，随机选择 3 个显微镜视野 (×400) 计数迁移到低层的细胞数。

2.7ELISA测定 各实验组12 h、24 h和36 h时点进行生长因子蛋白含量检测。采用ELISA 测定各组细胞培养上清液蛋白含量。严格按照试剂说明书进行操作，酶标仪测定450 nm处的吸光度，根据标准曲线分别计算样品中和含量。

2.8实时定量PCR检测 VEGF-A上游引物5’-AGGGCAGAATCATCACGAAGT-3’,下游引物5’-AGGGTCTCGATTGGATGGCA-3’。HGF上游引物5’-GCTATCGGGGTAAAGACCTACA-3’，下游引物5’-CGTAGCGTACCTCTGGATTGC-3’。IGF-1上游引物5’-CCACCTACGAGAAGTCAAGC-3’，下游引物5’-CGACTATGAAGACCCAGAAC-3’。内参照GAPDH上游引物5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物列5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。取各实验组12 h、24 h和36 h时点细胞，抽提总RNA，按照Trizol试剂盒说明操作；反转录形成cDNA，按试剂说明配制10 μL逆转录体系，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；实时荧光定量PCR,按照试剂说明配制20 μL PCR反应体系，反应条件为：预变性95 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，61 ℃ 34 s，共40个循环。Ct值表示目标扩增产物达到设定阈值经历的循环数。参考文献[10]计算ΔΔCt，采用相对定量法计算各组2-ΔΔCt。

3 统计学处理

实验重复3次以上，数据用均数±标准差(mean±SD)表示，利用SPSS 17.0 软件进行单因素之差分析和SNK-q检验， 以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 hADSCs培养与鉴定

原代hADSCs培养1 d后换液，部分细胞开始贴壁(图1A)。培养3～4 d贴壁细胞呈纺锤形，随后细胞开始集落生长(图1B)。细胞形态较均一，呈放射状排列，伸出长短不一、粗细不均的突起，核浆比例大。原代细胞大约10～12 d后铺满瓶底 80%(图1C), 即可消化传代，传代培养的细胞可在48 h 之内贴壁，呈长梭形、不规则形，生长旺盛，形成典型的 “漩涡状”形态，伴有突起，较原代细胞扁平，核较大，呈椭圆形，核仁明显，核浆比例大，6 d可铺满瓶底 80%，前期细胞传代过程中混杂大量其它类型细胞，通过 3 次传代可逐渐纯化hADSCs。第4代细胞的MSCs表面标志CD90阳性率为96.25%±1.58%，CD34阳性率为 1.11%±0.34%，CD105阳性率为 96.97%±1.53%，CD45阳性率为1.29%±0.97%，表明本次获得细胞为hADSCs，见图2。

Figure 1. Morphological feature of hADSCs under phase-contrast microscope (×200)．A: 1 d; B: 3 d; C: 10 d．

2 hADSCs向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的能力

hADSCs经成骨诱导21 d细胞内有明显矿物质沉积，四唑硝基蓝染色可见蓝紫色矿化结节；hADSCs经成软骨诱导22 d，艾茜蓝染色可见蓝色的软骨细胞；hADSCs经成脂肪诱导14 d，镜下细胞可见明显脂滴，经油红O染色脂滴呈红色，见图3。

Figure 2. Flow cytometric analysis of the hADSCs showed that CD90+ and CD105+ cells were the highest population.

Figure 3. The differentiation of hADSCs into osteoblasts, chondrocytes and lipoblasts (×200) . A: hADSCs differentiated to osteoblasts after culture with osteogenic medium, as detected by alkaline phosphatase staining; B: hADSCs differentiated to chondrocytes after culture with chondrogenic medium, as detected by Alcian blue staining; C: hADSCs differentiated to adipose cells after culture with adipogenic medium, as detected by oil red O staining.

3 AGE-BSA对hADSCs增殖的影响

与BSA对照组比较，50 mg/L和100 mg/L AGE-BSA作用12 h、1 d、2 d、3 d和4 d后，hADSCs增殖能力明显降低(P<0.05)，呈现浓度依赖效应，见表1。

4 AGE-BSA对hADSCs迁移的影响

与BSA对照组比较，50 mg/L和100 mg/L AGE-BSA作用hADSCs 24 h和36 h后， hADSCs迁移细胞数明显降低(P<0.05)，呈现浓度依赖效应，见图4。

5 AGE-BSA对hADSCs分泌 VEGF、HGF和IGF-1蛋白的影响

与BSA对照组比较，50 mg/L和100 mg/L AGE-BSA作用36 h，hADSCs培养液中的hADSCs分泌VEGF、HGF和IGF-1蛋白浓度明显降低(P<0.05)，呈现浓度依赖效应，见表2。

表1 AGE-BSA对hADSCs增殖的影响

Figure 4. The effect of AGE-BSA on the migration of hADSCs with different treatments at different time points.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs low dose of AGE-BSA.

表2 AGE-BSA对hADSCs分泌 VEGF、HGF和IGF-1蛋白的影响

6 AGE-BSA对hADSCs VEGF、HGF和IGF-1 mRNA表达的影响

与BSA对照组比较，AGE-BSA作用12 h、 24 h和36 h后，hADSCs VEGF、HGF和IGF-1 mRNA水平明显降低(P<0.05), 呈现浓度依赖效应，见图5。

Figure 5. The mRNA expression of VEGF (A), HGF (B) and IGF-1 (C) in the hADSCs of each group detected by real-time PCR.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs low dose of AGE-BSA.

讨 论

hADSCs作为一种成体间充质干细胞群，由于其无伦理问题，来源广泛，易获得，易扩增，目前已成为糖尿病患者细胞移植和基因治疗的有效载体[3-4]。本实验采用胶原蛋白酶消化和差速贴壁法分离培养hADSCs，并对其生物学特性进行初步观察，结果发现hADSCs与骨髓等其它组织来源的MSCs具有相似的特征，hADSCs高表达CD90和CD105，不表达CD34和CD45；在不同的诱导条件下被成功诱导分化为成骨、软骨和脂肪细胞，证实其具有多种分化潜能。

糖尿病皮肤溃疡是糖尿病严重慢性并发症，严重影响患者的生活质量。尽管自体hADSCs治疗皮肤溃疡取得了很好的效果，但是一些研究中仍然发现由于hADSCs功能损伤导致糖尿病患者皮肤溃疡愈合不良。血清AGEs 水平在高龄、动脉粥样硬化和糖尿病患者中显著升高[1-2], 患者体内高浓度的AGEs对hADSCs增殖和迁移可能起到了一定的抑制作用。本课题组前期的研究发现AGEs能促进内皮细胞和脐血间充质干细胞生成ROS, 抑制抗氧化酶生成，增强氧化应激，破坏细胞内环境稳定性，从而影响内皮细胞和脐血间充质干细胞生物学功能[11-12]。最近的研究也证实AGEs 对内皮祖细胞数量和功能也一定有影响[13-14]。本研究中我们通过对AGE-BSA 刺激后的hADSCs增殖和迁移能力检测，结果表明AGE-BSA能损伤hADSCs增殖和迁移潜能，从而影响hADSCs修复创伤的功能。

hADSCs促进创伤修复的作用机制一方面通过自身的增殖、迁移和分化；另一方面通过自分泌或者旁分泌影响损伤部位的多种细胞，如真皮成纤维细胞、炎症细胞、血管内皮细胞等等。而糖尿病皮肤溃疡愈合是上述多种细胞共同完成的。在多项关于糖尿病皮肤溃疡的研究中发现多种生长因子表达不足或者功能障碍是糖尿病皮肤溃疡不愈合的主要原因。VEGF、HGF和IGF-1是体内重要的生长因子，研究表明，hADSCs能分泌大量的 VEGF、HGF和IGF-1，而这些因子在创伤修复过程中起到非常重要的作用[3-5]。本研究中我们通过对AGE-BSA 刺激hADSCs后VEGF、HGF和IGF-1蛋白和mRNA表达的检测，结果证实AGE-BSA能抑制hADSCs分泌VEGF、HGF和IGF-1。由此推断，糖尿病患者体内高浓度AGEs损伤了hADSCs旁分泌功能，从而影响hADSCs修复创伤的功能。

本研究初步证实AGEs 能够损伤 hADSCs多种生物学特性。由此推断临床上应用hADSCs为糖尿病患者细胞移植和基因治疗时，患者体内高浓度AGEs能够损伤hADSCs促进创伤修复功能。深入研究AGEs对hADSCs功能与活性的影响及作用机制, 为临床上通过抗AGEs生成或基因修饰促进生长因子分泌等干预方法，提高干细胞移植治疗的促进创伤修复功能提供新的理论依据。

[参 考 文 献]

[1] Prasad A, Bekker P, Tsimikas S, et al. Advanced glycation end products and diabetic cardiovascular disease[J]. Cardiol Rev, 2012, 20(4):177-183.

[2] Vöö S, Dunaeva M, Eggermann J, et al. Diabetes mellitus impairs CD133+progenitor cell function after myocardial infarction[J]. J Intern Med, 2009, 265(2):238-249.

[3] Amos PJ, Kapur SK, Stapor PC, et al. Human adipose-derived stromal cells accelerate diabetic wound healing: impact of cell formulation and delivery [J]. Tissue Eng PartA, 2010, 16(5):1595-1606.

[4] Nambu M, Kishimoto S, Nakamura S, et al. Accelerated wound healingin healing-impaireddb/dbmice by autologous adipose tissue-derived stromal cells combined with atelocollagen matrix[J]. Ann Plast Surg, 2009, 62(3):317-321.

[5] Fiorina P, Pietramaggiori G, Scherer SS, et al. The mobilization and effect of endogenous bone marrow progenitor cells in diabetic wound healing[J]. Cell Transplant, 2010, 19(11): 1369-1381.

[6] Nie C, Yang D, Xu J, et al. Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis[J]. Cell Transplant, 2011, 20(2):205-216.

[7] Liu X, Wang Z, Wang R, et al. Direct comparison of the potency of human mesenchymal stem cells derived from amnion tissue, bone marrow and adipose tissue at inducing dermal fibroblast responses to cutaneous wounds[J]. Int J Mol Med, 2013, 31(2):407-415.

[8] 连 帆，王 于，范文哲,等. 经肝动脉同种异体脂肪干细胞移植治疗小鼠自身免疫性肝炎的实验研究[J]. 中国病理生理杂志, 2011,27(7):1389-1392.

[9] 刘晓玉，王 瑞，张 涛，等. 人脂肪间充质干细胞对皮肤创伤修复的作用[J]. 基础医学与临床, 2013, 33(11):1377-1381.

[10] 贾 青，张维东，王朝霞，等. 不同剂量乙醇对小鼠早期肝纤维化的影响及机制研究[J].中国病理生理杂志, 2010, 26(9):1801-1806.

[11] 王 哲，马 铁，杨向红. 普罗布考和辛伐他汀对高级糖基化终末产物诱导的大鼠肾脏微血管内皮细胞的ROS含量和HO-1表达影响[J]. 中国病理生理杂志, 2010, 26(9):1749-1752.

[12] 王 哲，王秋实，刘晓玉，等. 糖基化终末产物调节氧化应激影响脐血间充质干细胞增殖及普罗布考保护作用 [J]. 实用药物与临床, 2013, 16(4):273-276.

[13] Chen J, Song M, Yu S, et al. Advanced glycation endproducts alter functions and promote apoptosis in endothelial progenitor cells through receptor for advanced glycation endproducts mediate overexpression of cell oxidant stress [J]. Mol Cell Biochem， 2010, 335(1-2):137-146.

[14] Yamagishi S, Matsui T, Ueda S, et al. Advanced glycation end products (AGEs) and cardiovascular disease (CVD) in diabetes [J]. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem, 2007， 5(3):236-240.