张 恋， 方 严， 陈 婷,， 陈 可， 练雪梅△

(重庆医科大学 1感染性疾病分子生物学教育部重点实验室脂质研究中心，2公共卫生与管理学院营养与食品卫生学教研室，重庆 400016)

凋亡抑制因子6(apoptosis inhibitor 6，Api6)，也叫做AIM、Spα或者CD5L，是清道夫受体富含半胱氨酸残基B族成员[1]。早期研究发现Api6主要在巨噬细胞上表达，具有抑制多种刺激因素引起的细胞凋亡的作用[1-2]。最近研究表明，Api6在动脉粥样硬化斑块泡沫细胞里面有大量表达，而且它的大量产生促进动脉粥样硬化斑块巨噬细胞的存活，进一步研究发现，减少Api6的表达可以通过增加巨噬细胞的凋亡来减少斑块早期的发展[3]。当用高脂饮食喂养小鼠时，发现Api6基因敲除小鼠有显著的阻止巨噬细胞浸润到脂肪组织的作用[4]。我们以前研究发现，溶酶体酸性脂肪酶(lysosomal acid lipase,LAL)基因敲除小鼠肺部存在渐进性的慢性炎症，同时发现Api6的表达明显增高，而LAL在水解细胞甘油三酯和胆固醇酯中起着核心的作用[5-6]。至今尚不清楚高脂高胆固醇饮食是否会引起C57BL/6J小鼠的肺部炎症，而且研究Api6在此模型下对于小鼠肺部炎症的作用未见报道。本研究通过高脂高胆固醇饮食喂养小鼠建立模型，观察此模型下是否引起小鼠肺部炎症反应及Api6在该炎症反应中所扮演的作用。

材 料 和 方 法

1 动物和饲料

野生型C57BL/6J小鼠购买和饲养于重庆医科大学实验动物中心。小鼠的喂养和取材均在无特定病原体动物防护的SPF环境中完成。

6～8周的雄性C57BL/6J小鼠被随机分成2组，一组喂养高脂高胆固醇饮食[high-fat high-cholesterol diet，HFD/HCD;40 Kcal% 脂肪, 1.25% 胆固醇和 0.5% 胆酸盐(D12109c，Research Diets Inc.)]，另一组喂养匹配的正常饮食[regular diet, RD;10 Kcal%脂肪，不含胆固醇和胆酸盐(D12102c,Research Diets Inc.)]。饲养16周后取材进行实验。

2 主要仪器和试剂

2.1主要仪器 荧光定量PCR仪购自Bio-Rad；引物设计软件采用Primer Express Software Version 2.0；免疫印迹信号检测仪购自Fusion；流式细胞仪购自Becton Dickinsion；凝胶电流仪和电转仪购自Bio-Rad。

2.2主要试剂 CD68抗体购于武汉博士德生物工程有限公司；Api6抗体惠赠于日本东京大学Miyazaki教授；肝X受体肝X受体α(liver X receptor α,LXRα)抗体购于Santa；β-actin内参照蛋白抗体购于北京中杉金桥公司；RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒均购于大连TaKaRa；蛋白提取试剂盒和BCA法蛋白测定试剂盒均购于南京凯基生物有限公司；凋亡试剂检测盒购于罗氏公司；化学发光检测试剂购于Millipore；氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, oxLDL)购自广州奕源公司；ELISA试剂盒购自Raybiotech。

3 方法

3.1免疫组织化学实验 不同饮食喂养16周的小鼠被麻醉后，通过切断下腔静脉和左肾动脉放血致死。取出肺组织并放入4%多聚甲醛中4 ℃过夜，第2天再通过一系列梯度乙醇脱水后用石腊包埋。把石蜡标本切成5 μm厚度的切片后用兔多克隆抗CD68抗体作为Ⅰ抗进行孵育。洗涤后用生物素化标记的Ⅱ抗进行孵育处理。最后用辣根过氧化物酶标记的生物素-亲和素复合物进行检测并用二氨基联苯胺四盐酸盐作底物增强信号。

3.2蛋白的提取和蛋白印迹实验 肺组织使用凯基公司的蛋白提取试剂盒按说明书提取全蛋白并保存于-80 ℃冰箱。用凯基公司BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，并用蒸馏水标准化各组蛋白浓度使浓度一致。将蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移至硝酸纤维膜上，然后把该膜用相应Ⅰ抗和Ⅱ抗孵育，洗涤后用电化学发光试剂进行检测。蛋白条带强度用ImageJ软件进行定量分析。

3.3核酸的分离、扩增和分析 取出已经收集的小鼠肺组织手动匀浆并用Trizol试剂溶解，提取出RNA，用核酸扩增仪扩增成cDNA。用核酸扩增实时定量检测系统检测达到一定荧光值得所需要的循环次数(Ct值)。循环次数的标准值用肌动蛋白基因标准化，用ΔΔCt方法计算比较实验组和对照组基因变化。其中寡核苷酸引物序列如下：Api6上游引物5’-TGG CCA TCT TGA GCA TTT TTG-3’，下游引物5’-GCT GCA CTT TGG TTG GAG ACT-3’；LXRα上游引物5’-CAC GCC TAC GTC TCC ATC AA-3’，下游引物5’-GCA TCC GTG GGA ACA TCA G-3’；β-actin上游引物5’-GGC ACC ACA CCT TCT ACA ATG AG-3’，下游引物5’-GAC CAG AGG CAT ACA GGG ACA G-3’。

3.4流式细胞术检测细胞的凋亡 收集肺泡灌洗液细胞或培养的RAW264.7细胞，孵育在含2 μL膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素和2 μL碘化丙啶的100 μL结合液中，室温孵育15 min，流式细胞术检测细胞凋亡。收集的信号采用FACScan (Becton Dickinson) 软件分析。

3.5支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)的纯化和收集 麻醉解剖不同饮食饲养的小鼠，将气管分离并插入一个适配器，用1 mL无菌生理盐水注入小鼠肺内并收集，重复2次。将收集的约3 mL BALF在260×g离心15 min，取上清，采用ELISA检测炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosisfactor α,TNF-α)和单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemattractant protein 1,MCP-1)的表达；用1 mL磷酸缓冲液重悬细胞，用网格血细胞计数后送流式细胞室检测细胞凋亡率。

3.6肺泡II型上皮细胞(alveolar type Ⅱ epithelial cells,ATII细胞)的收集和纯化 将不同饮食饲养16周的小鼠麻醉解剖后暴露肺组织，通过肺动脉用注射器注入20 mL生理盐水进行肺灌洗后，然后在气管口注入3 mL的分散酶(dispase)并迅速盖上冰使其凝结；45 min后分离肺组织，放入含10 mL HEPES和DMEM培养基的60 mm培养皿中，在培养基中加入1×105U/L的DNA酶，然后用剪刀等工具分离肺组织细胞；分离出的细胞先后用100 μm孔径和40 μm孔径的滤网去除杂细胞，然后将滤过的细胞用血细胞相应的抗体孵育2 h以得到较纯净的ATⅡ细胞；最后将得到的ATII细胞在130×g、4 ℃离心8 min，将收集到的细胞用流式细胞术检测细胞凋亡率。

3.7RAW264.7细胞的培养和处理 小鼠来源的巨噬细胞株RAW264.7购于ATCC。把RAW264.7细胞培养在含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养基中，培养环境是37 ℃、5% CO2。为了确定oxLDL对该细胞的凋亡作用，将细胞培养在无血清培养基中(含0.2% BSA)培养12 h后加入不同浓度的oxLDL(0、50、100、150 mg/L)。为了证实重组的Api6蛋白在oxLDL诱导的RAW264.7细胞的凋亡中可以发挥作用，细胞分别给予150 mg/L oxLDL、500 μg/L重组Api6蛋白和150 mg/L oxLDL加上500 μg/L重组Api6蛋白处理。在培养24 h后收集细胞，用流式细胞术测定细胞凋亡率。

4 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示。各组间均数比较使用单因素方差分析(ANOVA)或t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。使用SPSS 11.0软件分析。

结 果

1 巨噬细胞在高脂高胆固醇饮食喂养组的肺中蓄积

高脂高胆固醇饮食喂养的小鼠BALF中细胞计数增加，见图1A。免疫组织化学结果显示，CD68阳性巨噬细胞呈现泡沫状，并聚集在高脂高胆固醇喂养的小鼠的肺泡腔内，见图1B。ELISA检测高脂高胆固醇饮食组小鼠BALF中TNF-α和MCP-1的表达水平分别为(240.42±6.87)ng/L和(110.83±0.79)ng/L，明显高于普通饮食组[(192.15±21.90)ng/L和 (81.78±3.69)ng/L,P<0.01]。

Figure 1. Pulmonary inflammaiton induced by 16 weeks of high-fat high-cholesterol diet (HFD/HCD) feeding. A: BALF cells were collected from 3 aliquots of 1 mL sterile normal saline bronchoalveolar lavage, total cell count was determined using a grid hemocytometer.Mean±SD.n=3～5.*P<0.05 vs regular diet (RD). B: immunohistochemical staining of pulmonary macrophages using anti-CD68 antibody (×400). Arrows points to the CD68-positive macrophages.

2 高脂高胆固醇饮食喂养组小鼠BALF细胞凋亡率减少

流式细胞术分析发现，相对于普通饮食组，高脂高胆固醇饮食喂养的小鼠BALF细胞的凋亡率明显降低，见图2A。与此相反，ATⅡ细胞凋亡率在普通饮食和高脂高胆固醇饮食组无明显差异，见图2B。由于BALF内的细胞大部分是巨噬细胞，因此该结果表明，在高脂高胆固醇饮食喂养16周的小鼠模型中，可以抑制巨噬细胞的凋亡而非ATII细胞的凋亡。

Figure 2. Flow cytometric analysis showed decreased pulmonary macrophage apoptosis in HFD/HCD-fed mice compared to RD-fed mice. Single-cell suspensions were prepared from BALF cells (A) or purified alveolar type II endothelial cells (B) of HFD/HCD-fed or RD-fed mice for FACS analysis. Distribution of annexin V (AV) and/or propidium iodide (PI) positive cells was presented in dot plots and percentage numbers were indicated. AV and PI-double negative cells are defined as live cells. AV-positive, PI-negative cells are defined as early apoptotic cells. AV and PI-double positive cells are defined as late apoptotic and necrotic cells. The analysis was repeated 3 times (n=3) and a representative experiment is shown.

3 高脂高胆固醇饮食喂养的小鼠肺组织中Api6和LXRα的表达增加

高脂高胆固醇饮食喂养小鼠LXRα mRNA和蛋白的表达明显上调，见图3A、C。Api6 mRNA和蛋白的表达也明显增加，见图3A、B。

Figure 3. Increased expression of pulmonary LXRα and Api6 in HFD/HCD-fed mice compared to RD-fed mice. A: real-time PCR analysis of Api6 and LXRα mRNA expression; B and C: Western blotting for the protein expression of Api6 (B) and LXRα (C) in the lungs. β-actin was used as the internal control.Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs RD.

4 重组的Api6蛋白可以抑制oxLDL引起的体外巨噬细胞凋亡

oxLDL处理细胞24 h可以诱导RAW264.7巨噬细胞产生剂量依赖性的凋亡，见图4A。加入500 μg/L重组Api6蛋白于150 mg/L oxLDL中共同培养，结果表明，重组的Api6蛋白可以有效地保护ox-LDL引起的RAW264.7巨噬细胞的凋亡，见图4B。

Figure 4. Api6 inhibited the apoptosis of murine macrophage RAW264.7 cells induced by oxLDL. A: dose-dependent manner of oxLDL-induced macrophage apoptosis in vitro. RAW264.7 cells were incubated with various concentrations of oxLDL in serum-free DMEM medium (containing 0.2% BSA). Apoptotic rate of cultured cells was determined after 24 h incubation by flow cytometry analysis. Distribution of annexin V (AV) and/or propidium iodide (PI) positive cells is presented in dot plots and percentage numbers are indicated. B: RAW264.7 cells were treated with oxLDL at 150 mg/L, recombinant Api6 at 500 μg/L and oxLDL plus recombinant Api6 in serum-free DMEM medium (containing 0.2% BSA). Apoptotic rate of cultured cells was determined after 24 h incubation by flow cytometery analysis. Distribution of AV and/or PI positive cells is presented in dot plots and percentage numbers are indicated.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs oxLDL.

讨 论

已有的研究结果表明，肺部的慢性炎症与内源性的胆固醇转运有很大关系，比如包括腺苷三磷酸结合盒转运体A1、三磷酸腺苷结合盒亚家族G1、载脂蛋白E基因等敲除小鼠中均有研究报道[7-9]。而我们的研究结果表明小鼠的肺部炎症同样在16周的高脂高胆固醇饮食喂养的C57BL/6J小鼠中发生，其主要证据是BALF细胞计数的增加，炎症因子表达的上调和泡沫状的巨噬细胞聚集在肺泡腔中(图1)。然而，这种由饮食诱导的肺巨噬细胞聚集的病理生理意义需要得到进一步研究。

既往研究多探讨高胆固醇血症对特定病原体感染引发的免疫应答的影响。在关于中性粒细胞调节炎症方面，高胆固醇血症对于脂多糖或者肺炎克雷伯菌的引起的肺部感染是有损宿主免疫的，主要原因是它可以减少肺泡中性粒细胞的聚集[10]。Smoak等[11]研究表明，LXR的活化受损会影响肺中性粒细胞的聚集从而使小鼠更易受胞外病原体的感染。

与此相反的是，巨噬细胞积极参与细胞内的感染，而且高胆固醇血症是胞内感染的保护性因素。低胆固醇血症已被证实是肺结核的主要危险因素[12]。Korf等[13]证实，LXR的配体可以抵抗由结核分枝杆菌引起的胞内感染。当对小鼠处以LXR的受体激动剂时，可以减少结核分枝杆菌的复制。而相反的是，缺乏LXRα和LXRβ基因的LXRα-/-LXRβ-/-双敲小鼠则表现为对该菌的易感增加和先天性与获得性免疫的缺陷。

LXRα-/-LXRβ-/-双敲小鼠同样也被证实非常易于感染其它胞内细菌，比如单核细胞增生利斯特氏菌、炭疽芽孢杆菌、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌[7]。LXR或者LXR/RXR的激活可以通过促进一些抗凋亡因子如凋亡抑制因子6(Api6/Spα/AIM)和 Bcl-XL的表达增加，影响胞内细胞感染相关炎症细胞的凋亡。

我们通过实验也证实了LXRα和Api6同样在高脂高胆固醇饮食喂养的C57BL/6J小鼠的肺中被激活(图3)，它们的激活可以部分解释由高脂高胆固醇饮食喂养16周引起的C57BL/6J小鼠肺中巨噬细胞的聚集(图2A)。而在正常生理状态下，肺泡腔内仅有少量巨噬细胞，巨噬细胞的大量聚集可导致肺内炎症的发生[14-15]。张丽丽等[16]的研究证实在肝纤维化大鼠肺泡腔内巨噬细胞明显增加并出现肺组织内TNF-α升高的炎症反应，而在我们的高脂高胆固醇饮食模型下的肺组织中也出现了以巨噬细胞聚集和TNF-α与MCP-1增高的肺部炎症反应。

[参 考 文 献]

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