黄东  吴保祥  王昉

[摘要] 目的 建立苯扎贝特酰化物中有关物质的测定方法。 方法 NUCLEOSIL 100-5 C18（5μm）0.125m×4mm；流动相为磷酸二氢钾溶液（2.72g/L，用磷酸调节pH2.3）︰甲醇=4︰6；检测波长：228nm；流速：1.0mL/min。 结果 苯扎贝特酰化物与主要杂质能得到有效分离，各杂质在0.2~3.5μg/mL范围内呈良好线性关系。 结论 本测定方法灵敏度高，准确可靠，可以控制苯扎贝特酰化物中有关物质的含量。

[关键词] 苯扎贝特酰化物；有关物质；系统适用性

[中图分类号] R927.2   [文献标识码] B   [文章编号] 2095-0616（2014）09-118-04

Related substances determination of bezafibrate acylate by HPLC

HUANG Dong1  WU Baoxiang1  WANG Fang2

1.Jiangsu Tasly Diyi Pharmaceutical CO., Ltd.， Huaian 223002, China; 2.Analytical＆Testing Center of Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China

[Abstract] Objective To establish an HPLC method for detection of the related substances. Methods The analytical column was NUCLEOSIL 100-5 C18 column (4.0mm×12.5cm, 5μm). The mobile phase was potassium dihydrogen phosphate (2.72g/L, adjust to pH 2.3 with phosphoric acid): methanol = 4:6 The flow rate was 1.0mL/min. The wavelenth was 228nm. Results A satisfactory separation condition for the five related impurities, the impurities standard curve was good linear over the range of 0.2-3.5μg/mL. Conclusion The method is sensitive and accurate and it can be used to determine the relateted substances of bezafibrate acylate.

[Key words] Bezafibrate acylate; Related substances; System suitability

苯扎贝特酰化物化学名N-对羟基苯乙基-4-氯苯甲酰胺，是合成降脂药苯扎贝特的重要中间体，目前它的合成主要以酪氨（对羟基苯乙胺)盐酸盐为原料，与对氯苯甲酰氯发生酰化反应后先生成中间体，不经分离与甲醇发生酯交换反应而得，再经缩合反应制得苯扎贝特，所以苯扎贝特酰化物的质量优劣直接关系到苯扎贝特产品的质量，在苯扎贝特酰化物的生产过程中，实际存在和可能产生的杂质有对羟基苯乙胺、4-氯-苯甲酸及一些未知杂质等。本文通过对苯扎贝特酰化物生产过程的监控，来确定其质量的优劣，为下一步苯扎贝特的生产提供有力的保证。

苯扎贝特酰化物原有的质量标准中只有性状、熔点、干燥失重、含量等项目，不能完全反应出其真正的质量，本文通过建立高效液相色谱法来测定其有关物质，来更好地控制苯扎贝特酰化物的质量，参考文献方法，本文采用高效液相色谱法建立了苯扎贝特酰化物中有关物质的分析方法，并对该方法的专属性、精密度、线性、回收率、检测限和定量限等进行了验证，均满足要求，方法可行。

1 仪器设备与试剂试药

高效液相色谱仪HPLC系统：沃特斯高效液相色谱仪2489检测器，2695分离单元（四元泵、717自动进样器、柱温箱）；软件：Empower3.工作站；HP1020打印机。

苯扎贝特酰化物标准品（lot：101169-201001）；甲醇（色谱纯201308066，江苏汉邦科技)；杂质对羟基苯乙胺lot：20131016，含量：99.8%)；杂质4-氯-苯甲酸（lot：130112，含量：100%阿拉丁化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱 C18（5μm）12.5cm×4mm。流速为1.0mL/min ；检测波长为228nm。流动相：磷酸二氢钾溶液（2.72g/L，用磷酸调节pH2.3）︰甲醇=400︰600； 进样量：20.0μL。

2.2 溶液制备

试验溶液：取本品50.0mg加流动相溶解稀释至100.0mL。

对照溶液（1）：吸取试验溶液10.0mL加流动相稀释至100.0mL，再吸上述溶液10.0mL加流动相稀释至100.0mL。

对照溶液（2）：吸取对照溶液（1）5.0mL加流动相稀释至50.0mL。

对照溶液（3）：取4-氯苯甲酸（杂质B）对照品2mg加流动相适量使溶解，加入2mL试验溶液用流动相稀释至50mL。

2.3 进样操作与系统适应性试验

系统平衡后，按照以上的色谱条件，在记录对照溶液（3）的色谱图中，两主峰分离度在1.5以上，在记录对照溶液（2）的色谱图中采用信噪比至少为5。

空白测试：取稀释溶剂进样，作为空白，表明稀释溶剂对杂质测定无干扰，在样品测定中出现溶剂峰的应忽略。

分别取20μL试验溶液和20μL对照溶液（1）、（2）、（3）注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2倍。

2.4 计算公式

总杂质含量（%)＝

式中：WS→配制对照液（a)的样品的重量，mg；

Wi→样品的重量，mg；

As→对照液（a)中主峰的峰面积。

→供试液色谱图中总杂质的峰面积。

2.5 结果判定

记录试验溶液的色谱图中，除主峰外，其他峰面积不得大于对照溶液（1）的主峰面积（1.0%）。除主峰外，所有峰面积的总和，不得大于对照溶液（1）的主峰面积的2倍（2.0%），小于对照溶液（1）的主峰面积的0.05倍的峰不记录。

2.6 方法的专属性

2.6.1 杂质及苯扎贝特酰化物的分子结构确认（委托南京师范大学分析中心检测) 通过紫外分光光度计、液相色谱-质谱、红外分光光度计等方法进行结构解析确证各杂质的分子结构[1-6]。

2.6.2 单个杂质的定性 依次取杂质对羟基苯乙胺（lot：20131016，含量：99.8%)10mg，至一个25mL容量瓶中，用稀释溶剂稀释至刻度，混合均匀。进样，记录色谱图，用保留时间对对羟基苯乙胺进行定性，杂质4-氯-苯甲酸（lot：130112，含量：100%阿拉丁化学试剂有限公司）10mg，至一个50mL容量瓶中，用溶剂稀释至刻度，混合均匀，进样，记录色谱图，用保留时间对4-氯-苯甲酸进行定性，取苯扎贝特酰化物对照品（lot：101169-201001）10mg至一个25mL容量瓶中，用稀释溶剂稀释至刻度，混合均匀。进样，记录色谱图，用保留时间对苯扎贝特酰化物进行定性。然后分别取上述三种溶液各5mL至50mL容量瓶中，用溶剂稀释至刻度，进样记录色谱图，各杂质的分离度和理论板数都符合规定，见图1。

2.6.3 高温破坏性试验 精密称取样品细粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，分别进行80℃高温烘箱中加热1、3、5、10d进行破坏性试验，用溶剂溶解稀释至制成1.0mg/mL的溶液。

2.6.4 光照破坏性试验 精密称取样品细粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，在4500L X光照下照射1、3、5、10d用溶剂溶解稀释至制成1.0mg/mL的溶液。

2.6.5 酸破坏性试验 精密称取样品细粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，分别加入1.0mol/L盐酸的1mL在100℃水浴中加热1、2、3、5h进行破坏性试验，再用1.0mol/L的氢氧化钠中和，再用溶剂稀释至制成1.0mg/mL的溶液。

2.6.6 碱破坏性试验 精密称取样品细粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，分别加入1.0mol/L的氢氧化钠1mL在100℃水浴中加热1、2、3、5h进行破坏性试验，再用1.0mol/L的盐酸中和，再用溶剂稀释至制成1.0mg/mL的溶液。

2.6.7 氧化破坏性试验 精密称取样品细粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，分别加入30%双氧水1mL在100℃水浴中加热1、2、3、5h进

图1  分离度色谱图

行破坏性试验，再用溶剂稀释至制成1.0mg/mL的溶液。

分别取上述溶液进样，记录色谱图，结果表明苯扎贝特酰化物经，高温、光照、酸、碱、氧化等破坏性试验所降解产生的杂质与主成分份均能有效分离，经对主成分峰的峰纯度分析，峰纯度均符合要求，表明该方法具有良好的专属性。

2.7 精密度和重复性

分别精密称取苯扎贝特酰化物10mg、对羟基苯乙胺10mg、4-氯苯甲酸10mg，与同一50mL容量瓶中，用溶剂稀释溶解并定容至刻度，在上述色谱条件下连续进样6次，记录色谱图，苯扎贝特酰化物的峰面积的RSD为1.1%，对羟基苯乙胺峰面积的RSD为0.9%，4-氯苯甲酸峰面积的RSD为1.3%，均小于2.0%。重复性和中间精密度符合规定。

2.8 杂质线性回归试验

标准贮备液：分别精密称取以下标准品：杂质对羟基苯乙胺、杂质4-氯-苯甲酸10.0mg，各至一个500mL容量瓶中，各加入流动相超声溶解并稀释至刻度，混合均匀，得到每个杂质的标准贮备液。每个杂质的浓度均约为20.0μg/mL。

分别取标准贮备溶液0.5，1.0，2.5，4，5，6，10mL分别至7个50.0mL容量瓶，用流动相稀释至刻度，制成浓度分别为0.2、0.4、1、1.6、2、2.4、4μg/mL的一系列溶液，摇匀，各精密量取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以各组分峰面积平均值对其浓度（μg/mL），进行线性回归分析，得到各组分的标准曲线。对羟基苯乙胺、4-氯-苯甲酸线性回归相关系数r分别为0.9995、0.9998均大于0.999，结果表明对羟基苯乙胺、4-氯-苯甲酸在浓度0.2~0.32ug/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.9 加样回收试验

精密称取已测定有关物质含量的样品适量，共3份，分别置50mL容量瓶中，加适量溶剂溶解，然后各精密加入已知浓度的对羟基苯乙胺，4-氯苯甲酸对照品的贮备液，制成相当于杂质80%、100%、120%的溶液并稀释至刻度，摇匀，按2.1项下色谱条件，进样，记录色谱图，计算对羟基苯乙胺、4-氯苯甲酸的含量，减去样品本底具有的含量，计算回收率，结果对羟基苯乙胺的平均回收率为： 99.2%，RSD=0.69%（n=9）；4-氯苯甲酸为100.1%， RSD=0.92% （n=9)。

2.10 杂质检测限的测定

在2.1色谱系统下进样，记录色谱图。当对羟基苯乙胺进样浓度为0.01μg/mL时，其色谱峰高约为基线噪音的3倍，当4-氯苯甲酸进样浓度为0.02μg/mL时，其色谱峰高约为基线噪音的3倍，当苯扎贝特酰化物进样浓度为0.005μg/mL时，其色谱峰高约为基线噪音的3倍，根据进样量20μL计算，对应的对羟基苯乙胺检测限为1ng，4-氯苯甲酸检测限为2ng，苯扎贝特酰化物检测限为0.5ng。

2.11 样品的稳定性

取同一供试品溶液分别于配制后0、2、4、8h内按“ 2.1”项下的色谱条件进行测定，记录峰面积，结果苯扎贝特酰化物的峰面积RSD为0.8%，对羟基苯乙胺的峰面积RSD为1.1%，4-氯苯甲酸的峰面积RSD为1.0%，表明溶液在8h内稳定。

2.12 样品有关物质测定

样品中有关物质测定结果见表1。

表1  样品中有关物质测定结果（%）

名称 批号

BZ1306001a BZ1306002a BZ1306003a

对羟基苯乙胺 0.05 0.08 0.10

4-氯苯甲酸 0.21 0.30 0.28

单个最大未知杂质 0.02 0.01 0.02

总杂质 0.50 0.56 0.53

取样品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，记录色谱图至主成分保留时间的2.5倍。按面积归一化法计算单一杂质及总杂质的含量，苯扎贝特酰化物样品杂质含量测定结果均符合标准规定[7]。

3 讨论

本实验考虑到后期成品的质量检测，且这几种物质在228nm处均有较大吸收，所以采用苯扎贝特成品的有关物质色谱条件来进行[8]。

溶剂的选用，考虑到苯扎贝特酰化物在流动相中也具有一定的溶解度，对于有关物质检查样品的浓度可以满足要求，所以选择流动相做为溶剂，也避免了其他溶剂对杂质的干扰[9-10]。

本实验采用高效液相色谱法法来检查苯扎贝特酰化物的有关物质，通过实验可以看到，本方法对杂质与主成分苯扎贝特酰化物能较好的分离，该方法简单易行并且具有良好的专属性[11-12]。

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（收稿日期：2014-03-12）