李 华 乔 莉 周颖仪

复方血栓通系列品种中四种皂苷通用检测方法研究※

李 华 乔 莉 周颖仪

目的 统一复方血栓通颗粒、片、滴丸和软胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法，使用Thermo ODS2（5 μm，150.0 mm×4.6 mm）色谱柱，柱温为20 ℃，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 ml/min，检测波长为203 nm。结果 三七皂苷R1在0.0518～2.5900（r=0.9996）、人参皂苷Rg1在0.2090～8.3588（r=0.9991）、人参皂苷Re在0.0507～2.5371（r=0.9990）、人参皂苷Rb1在0.2044～8.1752（r=0.9995）范围内与峰面积线性关系良好；精密度、重复性、稳定性及加样回收率结果均能满足分析要求。结论 该方法简单可行，为复方血栓通品种中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1含量测定方法的统一提供了可靠的依据。

复方血栓通；三七皂苷R1；人参皂苷Rg1；人参皂苷Re；人参皂苷Rb1；通用检测方法

复方血栓通颗粒、片、滴丸及软胶囊四种剂型同为系列品种，其处方均由三七、黄芪、丹参和玄参组成，具有活血化瘀、益气养阴的功效。现代药理研究表明[1-4]，三七皂苷类化合物（三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1）是复方血栓通发挥活血化瘀药效的主要物质基础。近年来，关于复方血栓通上述四种剂型中三七含量测定的文献报道包括：郭建明等[5]采用薄层扫描法测定复方血栓通滴丸中三七的含量，以人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1为测定指标；许俊音等[6]采用高效液相色谱法（HPLC）测定复方血栓通滴丸中人参皂苷Rg1的含量；何承队等[7]采用高效液相色谱法（HPLC）测定复方血栓通片中人参皂苷Rg1的含量等，而对于颗粒剂和软胶囊剂型的三七含量测定的方法尚未见文献报道。本实验建立了四种剂型中三七（以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1为指标性成分）的高效液相含量测定法，统一复方血栓通系列品种的三七定量分析方法，可以此作为评价此系列品种质量的重要指标。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Aglient1100高效液相色谱仪，KQ-300 DA超声波清洗仪，Sartorius-CP225D万分之一电子天平，Sartorius-CP224S十万分之一电子天平。

1.2 试药 乙腈为色谱纯，甲醇为色谱纯，水为超纯水[由Milli-Q水处理系统购自Millipore公司（美国）]，甲酸、乙醇为分析纯；三七皂苷R1（批号为110745-200617）、人参皂苷Rg1（批号为110703-200424；批号为110703-201027，含量以96.3%计）、人参皂苷Re（批号为110754-200822，含量以88.8%计；110754-201123，含量以89.1%计）、人参皂苷Rb1（批号为110704-201122，含量以92.9%计；110704-201223，含量以95.9%计），均购于中国药品生物制品检定院；复方血栓通颗粒、复方血栓通片、复方血栓通滴丸和复方血栓通软胶囊均为市售。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Thermo ODS2（5 μm，150.0 mm×4.6 mm）；乙腈（B）-水（A）；梯度洗脱：0～12 min，19%～19% B；12～60 min，19%～36% B；流速：1.0 ml/min；柱温：20 ℃；检测波长：203 nm；进样量：10 μl；以外标法测定。样品色谱中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1色谱峰均与其他杂质峰分离较好。理论板数按三七皂苷R1峰计算应不低于4000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别取三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1毫升含三七皂苷R1 50 µg、人参皂苷Rg1 200 µg、人参皂苷Re 50 µg、人参皂苷Rb1 200 µg的混合溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品，除去包衣，研细，精密称取适量（复方血栓通颗粒取约1.00 g、复方血栓通片取约0.40 g、复方血栓通滴丸取约0.30 g、复方血栓通软胶囊取约0.25 g），置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇25 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率300 W，频率45 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按处方比例取三七外的其他药材，按各自药品工艺项下的方法制成阴性样品，再按“2.2.2”项的方法制备阴性样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系的考察 分别精密吸取混合对照品溶液（浓度为三七皂苷R1 51.8 µg/ml、人参皂苷Rg1 208.971 µg/ml、人参皂苷Re 50.74245 µg/ml及人参皂苷Rb1 204.38 µg/ml）1、2、5、10、15、20 μl；三七皂苷R1对照品溶液（浓度为518 µg/ml）5 μl；人参皂苷Rg1对照品溶液（浓度为835.884 µg/ml）10 μl；人参皂苷Re对照品溶液（浓度为507.4245 µg/ml）5 μl；人参皂苷Rb1对照品溶液（浓度为817.52 µg/ml）10 μl，注入液相色谱仪，按“2.1”项色谱条件测定，分别测定各自峰面积，以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积值为纵坐标，进行回归处理，得三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的标准曲线方程，结果显示各标准曲线在线性范围内线性良好（表1）。

表1 四种成分的标准曲线

2.3.2 进样精密度试验 吸取混合对照品溶液（浓度为三七皂苷R1 50.12 µg/ml、人参皂苷Rg1 196.6 µg/ml、人参皂苷Re 45.833 µg/ml及人参皂苷Rb1 195.636 µg/ml）按“2.1”项色谱条件测定，分别连续进样6次，记录峰面积，计算三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re及人参皂苷Rb1峰面积的RSD（n=6）分别为1.7%、0.6%、2.1%、0.3%。

2.3.3 稳定性试验 取复方血栓通颗粒（批号为100801）、复方血栓通片（批号为120321）、复方血栓通滴丸（批号为120601）、复方血栓通软胶囊（批号为20120904），按“2.2.2”项供试品溶液制备制成供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，分别在0、3、7、11、15、19、23、27 h进样，测定峰面积，结果供试品色谱中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re及人参皂苷Rb1峰面积的RSD（n=8），结果表明供试品溶液在27 h内稳定（表2）。

表2 四种成分的稳定性试验(%)

2.3.4 重复性试验 取复方血栓通颗粒（批号为100801）、复方血栓通片（批号为120321）、复方血栓通滴丸（批号为120601）、复方血栓通软胶囊（批号为20120904），按“2.2.2”项的方法各平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项的色谱条件进样测定、计算。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re及人参皂苷Rb1峰面积的平均含量（mg/g）及RSD（n=6），见表3。

2.4 回收率试验

2.4.1 复方血栓通颗粒 精密称取已知含量的复方血栓通颗粒0.5 g，共6份，精密加入混合对照品溶液（浓度为三七皂苷R1 0.0406 mg/ml、人参皂苷Rg1 0.14170545 mg/ml、人参皂苷Re 0.015222735mg/ml、人参皂苷Rb1 0.1204913mg/ml）25 ml，按“2.2.2”项的方法制备溶液，按“2.1”项的色谱条件进样测定，计算回收率。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1平均回收率分别为102.9%、97.4%、101.7%、98.3%，RSD（n=6）分别为1.1%、0.8%、1.2%、0.6%。

表3 四种成分的重复性试验

2.4.2 复方血栓通片 精密称取已知含量的复方血栓通片0.2 g，共6份，精密加入混合对照品溶液（浓度为三七皂苷R1 0.04155 mg/ml、人参皂苷Rg1 0.1346274 mg/ml、人参皂苷Re0.01522273 mg/ml、人参皂苷Rb10.0840745 mg/ml）25 ml，按“2.2.2”项的方法制备溶液，按“2.1”项的色谱条件进样测定，计算回收率。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1平均回收率分别为103.6%、100.1%、101.4%、102.4%，RSD（n=6）分别为0.6%、2.2%、2.0%、0.7%。

2.4.3 复方血栓通滴丸 精密称取已知含量的复方血栓通滴丸0.15 g，共6份，精密加入混合对照品溶液（浓度为三七皂苷R1 0.01524 mg/ml、人参皂苷Rg1 0.1392127 mg/ml、人参皂苷Re 0.009499842 mg/ml、人参皂苷Rb1 0.0999278 mg/ml）25 ml，按“2.2.2”项的方法制备溶液，按“2.1”项的色谱条件进样测定，计算回收率。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1平均回收率分别为98.4%、103.8%、100.5%、96.7%，RSD（n=6）分别为0.6%、0.8%、2.6%、0.9%。

2.4.4 复方血栓通软胶囊 精密称取已知含量的复方血栓通软胶囊0.125 g，共6份，并加入混合对照品溶液（浓度为三七皂苷R1 0.0343125 mg/ml、人参皂苷Rg1 0.1792346 mg/ml、人参皂苷Re 0.01583307 mg/ml、人参皂苷Rb1 0.08933085 mg/ml）25 ml，按“2.2.2”项的方法制备溶液，按“2.1”项的色谱条件进样测定，计算回收率。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1平均回收率分别为98.5%、104.1%、98.1%、96.8%，RSD（n=6）分别为2.0%、0.3%、1.5%、0.7%。

2.5 样品测定 取复方血栓通颗粒（批号：100801、100901、130303、100902）、复方血栓通片（批号：120321、130318、130301、130302）、复方血栓通滴丸（批号：120601、120301、120401、120603）、复方血栓通软胶囊（批号：20120904、20130105、 20121208、130201），分别按“2.2.2”项的方法制备供试品溶液，按“2.1”项的色谱条件进样测定，记录峰面积，按外标一点法计算含量，见表4。

表4 复方血栓通样品三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re及人参皂苷Rb1的含量(mg/g)

3 讨论

3.1 提取溶剂的考察 经考察不同溶剂如50%甲醇、80%甲醇、100%甲醇、50%乙醇、80%乙醇、100%乙醇超声处理提取，结果：用50%乙醇和50%甲醇作为溶剂提取所得三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量较高，考虑到50%乙醇毒性较低，较为环保，且结合工艺制备过程中同样采用50%乙醇作为提取溶剂，确定提取溶剂为50%乙醇。

3.2 提取方式的考察 经考察不同超声提取（30、45、60 min）和加热回流（15、30、45、60、120 min）时间，结果：不同提取方法及时间，测得三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量基本一致，从节约成本和简化步骤角度考虑，确定提取方法及时间为超声提取30 min。

为保证本系列品种的内在质量，本研究选择了市场上常见的复方血栓通颗粒、复方血栓通片、复方血栓通滴丸及复方血栓通软胶囊四种剂型，建立了高效液相色谱法的通用检测方法测定三七皂苷类化合物（三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1）的含量。该方法准确可行，为评价复方血栓通系列品种的质量提供可靠的依据。

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[6] 许俊音,张曼丽.HPLC测定复方血栓通滴丸中人参皂苷Rg1的含量[J].现代医院,2008,8(7):81-82.

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Universal Method for the Determination of four saponins in Fufang XueShuanTong Preparations

Li Hua Qiao Li Zhou Yingyi

Objective To unified the method for the content determination of Notoginsenoside R1,Ginsenoside Rg1,Ginsenoside Re,Ginsenoside Rb1 of Fufang Xueshuantong granules,tablets,dripping pills and soft capsules. Methods By HPLC method;Notoginsenoside R1,Ginsenoside Rg1,Ginsenoside Re,Ginsenoside Rb1were analyzed on an Thermo ODS2(5 µm,150.0 mm×4.6 mm)column at 20 ℃;The gradient elution was acetonitrile-water at the flow rate of 1.0ml/min;The detection wavelength was 203 nm.Results Notoginsenoside R1,Ginsenoside Rg1,Ginsenoside Re,Ginsenoside Rb1 all have good linearity in the range of 0.0518～2.5900(r=0.9996),0.2090～8.3588(r=0.9991), 0.0507～2.5371(r=0.9990),0.2044～8.1752(r=0.9995)with satisfied precision,repetition,stability and recovery. Conclusion This method is simple,feasible,and can offer the reliable basis for unification of the standards.

Fufang XueShuanTong preparations;Notoginsenoside R1;Ginsenoside Rg1;Ginsenoside Re; Ginsenoside Rb1;Universal Method for the Determination

R286

A

1673-5846(2014)07-0014-04

广东省食品药品检验所，广东广州 510180

广东省中医药局科研课题（20131139）

李华（1975-），本科、硕士研究生，中药室主任，副主任中药师，主要从事药品质量分析与管理。Tel：020-81886161，E-mail：1060870904@qq.com