杨文慧，肖秋生，姜宗文，张 肃，宋海艳， 王殿荣 (.延边大学药学院，吉林 延吉000；.解放军08医院，吉林 长春 00；.浩特陶海牧场兽医站，内蒙古 海拉尔 0000)

胰岛素是目前用于治疗糖尿病最常用的药物，临床上主要用于治疗1型糖尿病(即胰岛素依赖型糖尿病)，在患者口服降糖药无效、过敏或病情加重条件下可作为治疗2型糖尿病(即非胰岛素依赖型糖尿病)而选择的药物[1]。因为胰岛素的特殊性质不宜口服给药只能注射给药，给患者带来了较大的不便和痛苦。

本试验研究采用温控型胰岛素液体缓释肛门栓给药新剂型，剂型以液体的形式进入直肠后，在生理温度下迅速由液体变为半固体凝胶态，固定在给药部位，可以有效地避免肝脏首过效应，提高药物的生物利用度[2]。笔者采用高效液相色谱法建立温控型胰岛素液体缓释肛门栓的含量测定的方法，并对其体外释放机制进行研究，以改善糖尿病患者的治疗方式和治疗效果。

1 仪器与试药

LC-10AVT高效液相色谱仪，SPD-10AV紫外检测器(日本岛津)，N-2000双道色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所)，AT-130柱温箱(天津市鑫州科技有限公司)，pHs-3C精密酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司)，微量电子天平CP225D(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，电磁搅拌器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)，THZ-82水浴恒温振荡器(金坛市华城创威实验仪器厂)。

胰岛素标准品(批号：5048708，27 u/mg，中国药品生物制品检定所)，胰岛素原料药(批号：1112A05，1203A10，1207A09，徐州万邦金桥制药有限公司)，泊洛沙姆407(批号：20111101，南京威尔化工有限公司)，泊洛沙姆188(批号：20110506，南京威尔化工有限公司)，壳聚糖(批号：20110316，国药集团化学试剂有限公司)，尼泊金乙酯(天津市华东试剂厂，批号：20111117)。甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯，水为重蒸水。

牛肠、羊肠购于内蒙古呼伦贝尔。

2 方法与结果

2.1方法 温控型胰岛素液体缓释肛门栓处方制备：本试验的凝胶基质选用的是泊洛沙姆407和泊洛沙姆188，秤取泊洛沙姆407 7.5 g，泊洛沙姆188 12.5 g，加入适量的水溶解，边加边搅拌，放置过夜；秤取壳聚糖200 mg，胰岛素175 mg，用适量2%的醋酸溶解，加入到泊洛沙姆溶液中，边加水边搅拌，加入0.05%尼泊金乙酯，将混合液放置于冰箱中10～12 h，使其充分水化，除去气泡，调节pH值，再加入适量的水，使其成50 g溶液。

2.2含量测定

2.2.1色谱条件 Welch ultimate C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：0.2 mol/L硫酸盐缓冲液(取无水硫酸钠28.4 g，加水溶解后，加磷酸2.7 ml，乙醇胺调pH至2.3加水至1 000 ml)-乙腈(74:26)；检测波长：214 nm；柱温：40 ℃；流速：1 ml/min，进样量20 μl[3]。

2.2.2系统适用性试验 精密取胰岛素对照品适量，加0.01 mol/ml盐酸溶液制成每1ml约含40 U的对照品溶液，室温放置24 h后，取20 μl注入高效液相色谱仪内，记录色谱图(胰岛素峰相对保留时间约为7.732 min)，理论塔板数为6 610，见图1。

2.2.3线性关系考察 精密称取胰岛素对照品13.8 mg，用0.01 mol/L盐酸溶液制成浓度为40.0 U/ml的储备液。分别精密量取上述储备液液，加入0.01 mol/L盐酸溶液稀释浓度分别为1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0 U/ml的一系列溶液，按“2.1”项下色谱条件取20 μl注入高效液相色谱仪，记录峰面积；以胰岛素浓度(U/ml)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程：Y=2×105X+690 136，r=0.999 1。结果表明：胰岛素在1.0～40.0 U/ml范围内与其峰面积呈较良好的线性关系。

图1 温控型胰岛素液体缓释肛门栓胰岛素对照品

2.2.4精密度试验 精密吸取同一对照品溶液(40 U/ml)，按“2.1”项下色谱条件，取20 μl进样，连续进样6次，测得胰岛素主峰面积的RSD为0.32%，表明仪器精密度良好。

2.2.5稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液(40 U/ml)，室温放置，按“2.1”项下色谱条件，取20 μl进样，分别在24、36、48 h进样分析，结果RSD为0.84%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.2.6重复性试验 取同一供试品溶液(40 U/ml)6份，按“2.1”项下色谱条件，测定峰面积，结果测得胰岛素峰面积的RSD为1.08%，表明该方法的重复性良好。

2.2.7加样回收率试验 取已知含量的供试品溶液1 ml共9份，置10 ml容量瓶中，分别加入3种不同浓度胰岛素对照品溶液，加0.01 mol/L的盐酸稀释到刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件取20 μl注入色谱仪，计算回收率，平均回收率(n=9)98.81%，RSD为1.15%。结果见表1。

表1 加样回收率试验

2.2.8样品含量测定 取3个批号的样品1 ml加入0.01 mol/L的盐酸稀释至10 ml，按“2.1”项下色谱条件及供试品溶液制备的方法，每个批号的样品连续进样3次，进行含量测定，结果见表2。

表2 3批温控型胰岛素原位凝胶肛门液体栓含量

3 体外药物释放的考察

3.1无膜溶出法 采用无膜溶出模型研究温控型胰岛素液体缓释肛门栓的溶蚀动力学，同时考察药物的体外释药机制[4]。称取20 g胰岛素原位凝胶液体栓剂加入到已知重量的100 ml烧杯中，置于(36±0.5)℃的水浴恒温振荡器中，预热20 min使溶液完全形成凝胶。加入生理盐水(36 ℃)2 ml作为释放介质，小心操作注意保持凝胶的表面完整，在恒温水浴振荡器(100 r/min)中振荡20 min[5]，然后将释放介质倾倒出来，用滤纸把烧杯外及凝胶表面擦干，并迅速称重记录，再加入生理盐水2 ml，再放入到水浴恒温振荡器中振荡20 min，依照上法反复操作8次[6]。相邻时间点的样品的重量之差为凝胶溶蚀量[7]。以凝胶累积溶蚀百分率对时间作图，得到凝胶溶蚀曲线，见图2。上述试验重复3次，RSD为0.35%。

图2 温控型胰岛素液体缓释肛门栓凝胶溶蚀曲线

将以上得到的释放介质用0.45 μm微孔滤膜滤过，按“2.1”项下色谱条件，取20 μl注入HPLC分析，测定药物浓度，上述试验重复3次，RSD为0.20%。以药物累积释放率对时间作图，得到药物释放曲线，结果见图3。

图3 温控型胰岛素液体缓释肛门栓累积释放率曲线

结果表明，药物的溶蚀方程为A=0.4587t+8.487 3(r=0.992 9)；药物的体外释放方程为Q=0.495 4t-2.611 8(r=0.997 7)。可知温控型胰岛素液体缓释肛门栓在无膜释放模型中药物是通过溶蚀作用进入人体的。

3.2牛肠黏膜释放研究 牛肠黏膜的制备：将刚宰杀的牛肠取出，切开牛肠，用镊子将覆盖在牛肠黏膜上的脂肪剔除，小心的将肠膜剥离出来，用生理盐水清洗干净，平整的放在锡箔纸上包好，于-15℃冷冻保存。

采用Franz扩散池(自制装置)，供给室与接受池的容积均为7.5 ml，扩散面积为0.97 cm2，接受池内加入36 ℃的生理盐水，将牛肠黏膜的黏膜层向上固定在供给室与接受池之间，置于温度为(36±0.5)℃的恒温水浴振荡器中平衡20 min，取温控型胰岛素原位凝胶肛门液体栓200 μl均匀覆盖在牛肠黏膜上。分别在15、30、45、60、90、120、180、240、300、360 min从接收池取样200 μl，每次取样后补加等量的36℃的释放介质，将以上得到的样品用0.45 μm微孔滤膜滤过供HPLC分析，测定药物浓度，计算累积释放量，以累计释放率对时间作图[8]，见图4。上述试验重复3次，RSD为0.79%。

图4 温控型胰岛素液体缓释肛门栓

得出的数据分别用Higchui方程、Ritger-Peppas方程、Hixson-Crowell方程进行拟合结果列于见表3。结果表明：牛肠黏膜的最佳曲线拟合：(1-Q)1/3=0.001 6t+2.927 4(r= 0.975 6)，符合Hixson-Crowell方程。在使用牛肠黏膜进行体外释放研究时药物是通过溶蚀方式释放的。

表3 温控型胰岛素液体缓释肛门栓牛肠黏膜体外释放曲线拟合

3.3羊肠黏膜释放研究 羊肠黏膜的制备：将刚宰杀的羊取出肠管并切开，用镊子将覆盖在羊肠黏膜上的脂肪剔除，小心的将肠膜剥离，用生理盐水清洗干净，平整的放在锡箔纸上包好，于-15 ℃冷冻保存。

采用Franz扩散池(自制装置)，供给室与接受池的容积均为7.5 ml，扩散面积为0.97 cm2，接受池

内加入36 ℃的生理盐水，将羊肠黏膜的黏膜层向上固定在供给室与接受池之间，置于温度为(36±0.5) ℃的恒温水浴振荡器中平衡20 min，取温控型胰岛素原位凝胶肛门液体栓200 μl均匀覆盖在羊肠黏膜上。分别在15、30、45、60、90、120、180、240、300、360 min从接收池取样200 μl，每次取样后补加等量的36 ℃的释放介质，将以上得到的样品用0.45 μm微孔滤膜滤过供HPLC分析，测定药物浓度，计算累积释放量，以累计释放率对时间作图，见图5。上述试验重复3次，RSD为0.55%。

图5 温控型胰岛素液体缓释肛门栓

得出的数据分别用Higchui方程、Ritger-Peppas方程、Hixson-Crowell方程进行拟合见表4。结果表明：羊肠黏膜释放的最佳曲线拟合：lnQ=0.878 3lnt-4.931 1 (r=0.970 5)，符合Ritger-Peppas方程，在使用羊肠黏膜进行体外释放研究时药物是通过扩散与溶蚀相结合的方式释放的。

表4 温控型胰岛素液体缓释肛门栓羊肠黏膜体外释放曲线拟合

4 讨论

通常直肠缺乏规律性的蠕动，直肠内的液体的量在2～3 ml，pH值7.3左右[9]。本试验自制了简易的模拟装置，模拟凝胶在直肠环境下逐渐溶蚀和扩散的过程，研究凝胶在人体内的释放。 试验还证实，通过计算药物累积释放率可以得出本凝胶有一定的缓释作用。

本试验利用无膜释放试验考察温控型胰岛素液体缓释肛门栓的溶蚀过程，药物是通过扩散作用进入人体的，并不是因为凝胶的溶蚀作用；采用生物膜(牛肠黏膜和羊肠黏膜)释放是为了模拟人肠黏膜对药物的吸收情况，采用多种回归方法进行拟合，Higchui方程是反映扩散机制的，Ritger-Peppas方程是验证机制的，Hixson-Crowell方程是反映溶蚀机制的，拟合后可知凝胶中的药物主要是通过溶蚀和扩散方式释放的。温控型胰岛素液体缓释肛门栓的药动学及药效学还有待进一步研究。

【参考文献】

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[7] 冯 敏,何 文.眼用维生素A棕榈酸酯阳离子脂质体原位凝胶的研制及体外释药研究[J].中国药师,，2010,13(5):631.

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[9] 梁文权.生物药剂学与药物动力学[M].北京:人民卫生出版社,2003:79.