摘 要：该文综述了现代色谱技术、光谱技术和分子标记技术等分析技术在珍稀药用植物-霍山石斛的化学成分、组效研究、物种鉴定和亲缘关系研究中的应用及其最新研究成果。

关键词：霍山石斛；现代分析技术；应用

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）12-17-05

霍山石斛（Dendrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng），史称霍石斛、又称米心石斛（米斛）属未进化的兰科石斛属植物。其含有多糖类、生物碱类、联苄类、菲类、氨基酸、倍半萜类等[1-2]，具有增强机体免疫力、调节血糖浓度、抑制肿瘤、明目、提高人体抗氧化水平、抑制血小板凝集、降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老和退热止痛等药理作用[3]。为大别山区特有种，是安徽省霍山县出产的道地药材，是唯一以地名命名的石斛属物种，2007年被国家质检总局定为国家地理标志产品。

霍山石斛记载最早见于清代赵学敏《本草纲目拾遗》，距今有130a（张应昌编缮初刊）至250a以上（赵学敏完成初稿）历史。因现有市场存量过少，不能作为大宗药材购买，因此在1995版、2000版、2005版、2010版的《中华人民共和国药典》的修订中均没有出现。霍山石斛植株矮小，种子细小无胚乳，在自然状态下发芽率极低，自然分布区域狭窄，仅限于大别山区的安徽霍山、金寨、岳西，湖北英山，河南南召等大别山脉系地区，是石斛属唯一分布于长江以北的种[4-6]。在我国兰科石斛属12个极危级物种中就有霍山石斛[6]。1987年，国务院将其列为野生药材二级保护品种。近几十年，霍山石斛市场价格不断攀升，贵比黄金。为保护珍稀濒危药用植物霍山石斛的种质资源，推进中药霍山石斛资源的可持续开发利用，霍山石斛的规模化繁育技术、仿野生栽培技术正在得到不断发展[7-9]，有关霍山石斛的化学成分提取、分离鉴定和药理药效的研究也在深入开展[10-12]。

中药现代化建设的核心是标准化的建立，标准化包括种质资源标准化和质量控制标准化，其中种质资源标准化是前提，质量控制标准化保障，本文将从种质资源和质量控制两个角度，就现代色谱技术、光谱技术和分子标记技术等分析技术在药用植物-霍山石斛的物种鉴定、亲缘关系、化学成分和组效关系研究中的应用综述如下：

1 现代分析技术在霍山石斛的物种鉴定，亲缘关系和遗传稳定性中的应用

随着现代分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已发展了3个阶段，分别是基于酶切技术的酶切片段长度多态性的分子标记技术，基于PCR技术的扩增片段长度多态性的分子标记技术，和基于核苷酸测序技术的单核苷酸差异的分子标记技术，这些技术广泛地应用在物种的鉴定上。由此衍生的分子标记类型多样，功能各异，目前应用到霍山石斛种质资源研究的分子标记技术有rDNA ITS，ISSR，SSR，RAPD，DALP等分子标记技术[13，14]。代表成果如下：

1.1 霍山石斛鉴别 如何有效的区分霍山石斛及其近缘种，是规范霍山石斛市场的必须要解决的问题。分子标记技术能在分子层面，在植株发育的各个阶段，实施有效的检测。

邓辉等[15]对霍山石斛及其同属相似种进行ISSR分子标记比较研究，结果表明，霍山石斛及其相似种在ISSR分子标记指纹图谱上存在着显著而稳定的差异。根据ISSR分子标记指纹图谱所显示的多态性位点差异，能准确鉴别霍山石斛及其相似种和霍山石斛与其它石斛的杂交种。其方法简单、稳定、重现性好，在霍山石斛的分子鉴定研究中有实际的应用价值。刘石泉等[16]利用石斛属植物基因库中rDNAITS序列数据库进行同源性比较，在与霍山石斛差异较大的区段设计出霍山石斛的1对位点特异性鉴别引物，结果发现在退火温度为60℃时，该引物能把霍山石斛的模板从19份石斛属植物中扩增出来，而其他的石斛属植物均为阴性，证明是一种能对霍山石斛的真伪进行准确鉴别的有效方法。

1.2 霍山石斛分类 霍山石斛分类学地位的认定一直存在争议，不同的分子标记技术可以从不同的角度对霍山石斛和其他种属的遗传关系进行更加合理的判定。

丁小余等[17]探讨霍山石斛与同属近似种：细茎石斛、曲茎石斛、铁皮石斛药材鉴别的形态及DNA分子证据，对霍山石斛及其近似种的药材进行了外部形态和rDNA ITS序列比较。结果霍山石斛及其近似种在rDNA ITS序列上却存在着显著而稳定的差异。霍山石斛与细茎石斛的rDNA ITS序列差异最小绝对遗传距离为15，而与曲茎石斛的差异较大，绝对遗传距离为42。

金国虔等[18]利用AP-PCR方法对4种霍山来源的石斛属植物基因组DNA进行了多态性分析，从75种随机引物中筛选出10种扩增条带清晰、稳定的随机引物，通过PCR扩增共获得250条DNA片段；利用NT-syspc分析软件对不同石斛品种间的平均遗传距离进行了分析，并利用UPGMA聚类分析方法构建它们的亲缘关系聚类图，结果表明4种霍山来源的石斛品种具有较近的亲缘关系，它们之间的平均遗传相似系数为0.63，其中铁皮石斛和铜皮石斛的亲缘关系最近，两者间的遗传相似系数为0.78，它们与串珠石斛的遗传相似系数分别为0.6和0.61，与霍山石斛的遗传相似系数分别为0.63和0.58；但是，相对于形态接近的铜皮石斛，铁皮石斛与霍山石斛的亲缘关系更近，这为霍山石斛物种的分类定位和道地性成因提供了参考依据

1.3 霍山石斛遗传稳定性

大规模的组培快繁技术是拯救和利用霍山石斛资源的有效途径，但不同材料间的遗传变异程度如何，同一材料间的遗传稳定性差异如何，是组培工作必须首先考虑的问题。

邱婧等[19]分别以霍山石斛成熟种子、茎段和愈伤组织为试管苗的初始材料进行继代培养，利用RAPD、ISSR以及DALP 3种分子标记方法对不同继代次数（1～4代）的霍山石斛试管苗进行分析，结果表明：以成熟种子和茎段为材料的继代培养，其试管苗后代在所检测的范围内未探查到变异，具有较高的遗传稳定性.以愈伤组织为材料的继代培养，其试管苗后代从第4代开始，部分引物带型的强弱发生改变。表明以愈伤组织为出发材料的继代培养种内存在一定的变异，但在4代以内仍可稳定遗传。3种继代方式比较之下，以成熟种子和茎段为材料的继代培养是更能稳定遗传的组培快繁方式。刘石泉[20]等研究霍山石斛同一蒴果组培不同生长阶段遗传稳定性方法：利用从20个随机引物筛选的3个稳定性较好的10碱基引物对已继代7～8次的H23种群进行RAPD检测结果：发现不同阶段内遗传相似系数较大，在85.409 3%～98.360 6%，其中在原球茎、萌芽期和一叶期存在的变异比两叶期、开花期要显著，但程度都极其微弱.结论：来自同一蒴果的变异非常小，建立霍山石斛稳定的无性快繁系是切实可行的。这为利用组培技术快繁霍山石斛的遗传稳定性提供了重要理论依据。

2 现代分析技术在霍山石斛的化学成分和组效关系中的应用

现代色谱技术色谱分离技术主要包括气相色谱分离模式、液相色谱分离模式到毛细管电泳分离模式，可以有效解决中药复杂体系分离问题[21]。光谱分析方法是现代仪器分析中一类极其重要的技术手段，光谱分析方法主要包括：紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、核磁共振光谱（NMR）、质谱光谱（MS）。光谱分析信号不仅包含物质量的信息，同样还包含物质组成、结构和性能的信息，光谱技术是药物的结构分析和性质鉴定的最常用手段[22]。

活性代谢产物是中药霍山石斛发挥功效的物质基础，是建立质量控制标准化的指示性物质。虽然从石斛属植物中已经分离鉴定出生物碱类、倍半萜类、菲醌类、联苄类、芴酮类、香豆素类、甾体类、三萜苷类以及挥发油等多种小分子化合物，但霍山石斛的药用成分及其组效关系的研究仍十分有限，主要原因是材料珍稀，难以提供足量的供试样本。多数学者的研究侧重于总生物碱、总多糖含量的测定[23-25]。目前各种先进的色谱技术和光谱技术已应用到霍山石斛的化学成分和组效关系研究中。

2.1 多糖类 霍山石斛是珍稀中药材[26]，传统医学认为其具有滋阴消渴、生津润肺、清音明目等功效。现代药理研究证明，多糖是霍山石斛的主要活性成分之一，具有预防心血管疾病、提高免疫力以及显著的抗白内障和抗癌功效[1，27-34]。其代表研究成果如下：

简政[35]霍山石斛经由冷水萃取得到O-acetylglucomannan多醣。此黏液多醣是经由DEAE离子交换树酯及SEC管柱层析纯化分离而得。这由霍山石斛中分离出的黏液多醣经由核磁共振仪、质谱仪及高效阴离子交换色谱-脉冲安培仪分析其主干为1，4连结的β-D-甘露糖和1，4连结的β-D-葡萄糖比例为10∶1。经由核磁共振仪分析，在部分甘露糖的2号及3号位置上含有乙酰取代基比例为34%不规则的散布在O-acetylglucomannan上。利用高效液相色谱及核磁共振仪并用已知分子量的普鲁兰多醣为标准品分析其分子量为1.0×104。小鼠脾脏细胞及人类周边单核血球细胞的实验模式中，从霍山石斛中萃取得到的O-acetylglucomannans可以诱发几种细胞激素的产生，包含有IL-6、IL-10、IFN-γ、G-CSF、M-CSF和GM-CSF。其中，G-CSF在此黏液多醣诱发几种细胞激素的产生最显着的生物性指标。相对的再黏液多醣去除乙酰取代基后，多醣诱导小鼠脾脏细胞激素产生的活性消失。

黄静等[36]研究霍山石斛多糖DHP对四氯化碳致急性肝损伤小鼠的保护作用.通过建立小鼠急性肝损伤模型，连续给药2d，每天1次测定小鼠血清ALT和AST及肝匀浆中SOD，MDA含量，免疫组化法观察肝细胞中TNF-α表达水平，HE染色观察肝脏病理组织学变化.结果表明霍山石斛多糖DHP各剂量组均能降低CCl4致小鼠急性肝损伤血清ALT，AST的升高，降低肝匀浆中MDA含量，增强SOD的活性，抑制肝细胞中TNF-α表达，减轻CCl4对肝组织的病理损伤.说明霍山石斛多糖DHP对CCl4致小鼠急性肝损伤具有一定的保护作用，其保护机制可能与清除自由基，抑制脂质过氧化，抑制TNF-α表达有关。该霍山石斛DHP单糖组成分析显示主要由木糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖4种单糖按照1.785∶16.513∶1∶4.216的比例组成，不同于已报道的具有肠道免疫调节活性多糖的单糖组成，表明DHP可能具有一种新的调节肠道免疫的活性结构。

黄森等[11]优化了霍山石斛多糖的提取工艺，纯化分离了多种多糖组分，重点研究了霍山石斛多糖对人胃腺癌细胞SGC-7901的抑制作用，探讨了多糖抗肿瘤作用与肿瘤相关基因之间的相关性。通过单因素实验结合Box-Behnken设计和响应曲面分析，建立了提取温度、提取pH和提取时间与霍山石斛多糖提取率间的数学模型。水提获得的霍山石斛粗多糖HDP通过DEAE-纤维素离子交换色谱分离得到多糖HDP-1，HDP-2，HDP-3，HDP-4，HDP-5，HDP-6。其中抗胃癌活性最强的多糖HDP-2经Se：phacryl-200HR色谱后，又获得HDP-2-A和HDP-2-B两种多糖组分，经UV扫描不含蛋白。多糖组份HDF-2对胃腺癌细胞SGC-7901的作用在荧光定量RT-PCR下检测得到，多糖组份HDP-2明显下调胃腺癌细胞SGC-7901中原癌基因c-myc的表达，仅为对照组表达率的42.34%。同时大幅提高肿瘤抑制基因野生型p53的表达，为对照组表达率的2.042倍。

2.2 生物碱、黄酮类 生物碱是霍山石斛的主要活性成分之一，与霍山石斛多糖等其他成分一起共同作用起效，其成分和结构也在不断的发现和研究中[37]。主要代表成果如下：

温云飞等[19]对霍山石斛进行了生物碱的提取分离和初步结构测定与体外癌细胞药理筛选和在霍山石斛浸液诱导下的人癌细胞进入apotosis过程的鉴定.细胞形态学观察和分子生物学实验表明，霍山石斛全草浸提液可诱导相应的人癌细胞进入apoptosis，该过程具有细胞膜发泡现象和（作用一定时间内）DNA Ladder特征电泳带，并且在给药24h后，不同的全草液对相应的癌细胞株在FACS检测细胞的DNA Content时有较高凋亡峰出现.并且此种抑制作用对人癌细胞的毒性很小，下一步Signal Pathway Transduction的研究正在进行中。

陈乃东[38-39]等研究了组织培养条件和野生环境条件下，霍山石斛生物碱提取物在成分数量和含量上的差异，指出试管苗野外移栽驯化植株与野生植株总生物碱、总多糖、总黄酮含量明显不同，三者中总生物碱含量从多到少依次为：野生植株>试管苗移栽驯化植株>试管苗；三者中总黄酮含量从多到少依次为：野生植株（0.5%）>试管苗移栽驯化植株（0.3%）>试管苗（0%）；三者总多糖含量从多到少依次为：试管苗移栽驯化植株（4.6%）>野生植株（3.5%）>试管苗（2.3%）；在对基于生物碱、黄酮的指纹图谱研究发现，霍山石斛试管苗移栽驯化植株HPLC检测到的共有指纹峰数量、峰面积与野生植株明显不同，栽培植株在活性成分的组成上比野生植株明显趋于简单，相同组分的含量也存在显著不同；采用HPLC-DAD-CL联用技术对霍山石斛总黄酮体外抗氧化谱效关系研究显示，试管苗移栽驯化植株缺失的或峰面积减少部分指纹峰具有较强的体外抗氧化活性，这些活性成分的缺失或下降必然导致药材的整体药效下降。上述研究结果提示，比起野生植株，试管苗移栽驯化植株中主要活性物质种类及含量的明显减少、药效下降，从药效物质基础角度出发，来源于试管苗移栽驯化植株，其品质明显下降。

2.3 其它类 霍山石斛不同的提取物，虽然成分不能完全阐明，但也会产生各种生理、药理结果[40]，其代表实验如下：

张静等[12]探讨霍山石斛提取物（Water extracts from Dendrobium huoshanense，WEDH）对人喉癌细胞株Hep-2增殖和凋亡的影响及其机制。分别用3.75、7.50、15.00、30.00和60.00mg/mL的WEDH处理Hep-2细胞，采用MTT法检测各组细胞的增殖水平；倒置相差显微镜观察细胞的形态学变化；Annexin V-FITC/PI双染色激光扫描共聚焦显微镜观察细胞凋亡；Fluo-3AM标记激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内游离Ca2+浓度；分光光度法检测细胞的Caspase-3活性。结果显示WEDH可明显抑制Hep-2细胞增殖，且呈时间和剂量依赖性，作用24、48和72h的IC50值分别为48.54、26.67和14.93mg/mL；经WEDH作用48h的细胞形态均发生显著改变，呈现典型的细胞凋亡特征，且呈浓度依赖性，细胞内Ca2+浓度和Caspase-3活性均显著高于阴性对照组（P<0.05）。WEDH对Hep-2细胞具有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用，其机制可能与升高细胞内Ca2+浓度，激活Caspase-3有关。

吴荣灿[41]本发明提供了具有生理活性的霍山石斛植物萃取物及其制备方法。该萃取物是通过将该植物体以水溶性有机溶剂萃取或以包含水溶性有机溶剂与水的组合物萃取而获得；所使用的水溶性有机溶剂主要选自含碳数介于1～8的醇类、烷类及酯类，其中该萃取物具有调控视网膜黑色素上皮细胞作用的功效。

3 结论

综上所述，采用现代分析技术可以得到霍山石斛不同个体的DNA分子和化学成分信息，在进行对比和分析后，可以获得霍山石斛各个体分子遗传特征和未知物质整体的质量水平情况。同时，采用现代分析技术，是实现多种成分整体相关质量评价的关键技术。也是霍山石斛物种鉴别、质量鉴定、开发研究的必要技术手段。

随着各种现代分析技术的创新与提高以及世界各国对天然药物的了解和研究的不断深入。霍山石斛的种质资源和质量控制的研究工作将会从方法层面逐渐向规范标准的方向发展，从而推动药用霍山石斛研究和开发更加成熟和完善，其研究成果将大大提升霍山石斛品质的水平，以造福社会。

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（责编：徐焕斗）