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（1.浙江新银象生物工程有限公司，浙江台州 317200；2.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；3.工业发酵微生物教育部重点实验室，天津 300457）

1921年Hopkins首先发现了谷胱甘肽，并命名为glutathione（GSH），其化学结构在 1930 年得到确定[1]，由L-半胱氨酸、L-谷氨酸和甘氨酸缩合而成[2]。GSH是体内重要的抗氧化剂，能减少氧化剂对巯基的破坏作用，保护细胞膜中含巯基的蛋白质不被氧化[3]。谷胱甘肽不仅具有解毒作用，而且可以作为功能性食品添加剂[4]，在肉制品中添加GSH可以强化风味，添加到水果罐头中可以防止色素沉积等[5]。

压力对细胞代谢的影响已有相关报道[6-7]。压力一方面影响微生物酶促反应进而使微生物细胞代谢发生改变，另一方面压力会影响微生物基因及相关蛋白的表达，从而改变微生物细胞的代谢[8]。压力大小和保压时间、加压前培养时间、升降压速率、培养基成分、温度、pH等[9-11]压力作用条件都会对微生物产生一定的影响。本文研究了温和压力（0.1 MPa～5.0 MPa）对面包酵母CICC1447生物合成GSH的影响，得到最优加压条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1447由工业发酵微生物教育部重点实验室（天津科技大学）保藏；四氧嘧啶ALLOXAN（分析纯）购自Sigma公司；GSH标品（色谱纯）购自上海生工生物工程有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HA-X型高压反应设备：海安县石油科研仪器厂；CR22G II高速冷冻离心机：日本日立公司；FACSC alibur型流式细胞仪：美国碧迪公司；752型紫外光栅分光光度计：上海精密仪器科学技术有限公司；SCIENTZ—ⅡD超声波破碎仪：宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵实验

从保藏斜面上挑取1～2环菌体，接入YEPD种子培养基中，温度30℃，转速150 r/min摇床培养16 h～24 h后，再以10%的接种量接入发酵培养基（酵母膏5 g/L、葡萄糖 30 g/L、硫酸镁 1.5 g/L、硫酸铵 5 g/L、硫酸钾3.6 g/L、磷酸二氢钾1.0 g/L、硫酸锰0.008 g/L，硫酸亚铁0.008 g/L、pH 6.0[12]），进行扩大培养。500 mL三角瓶中装液量为100mL、30℃、150r/min培养20h后转入高压反应釜进行加压发酵，同时以常压发酵作为对照。

1.3.2 GSH质量浓度测定

利用温差破碎法提取GSH，采用四氧嘧啶法进行GSH质量浓度测定[13]。

1.3.3 菌体量的测定

采用烘干恒重法测定菌体量[14]。

1.3.4 细胞存活率及活细胞数的计算方法

采用美兰染色并用血球计数板进行测定[15]。

1.3.5 染色剂与胞内DNA结合产生荧光的强度测定

参照肖安风等人的方法用生理盐水悬浮离心收集的酵母细胞[16]，制成约1×107cells/mL的细胞悬液，在500 μL 细胞悬液中加入 75 μg碘化丙啶（PI），避光反应5 min。将染色好的样品放入流式细胞仪，荧光激发波长为488nm，使用660/16nm带通滤片检测PI荧光强度。

2 结果与分析

2.1 常压发酵实验

为了研究温和压力对面包酵母谷胱甘肽生物合成能力的影响，对面包酵母进行常压发酵试验，作为对照见图1。

由图1可知，发酵27 h时菌体量达到最大，同时GSH质量浓度也达到最大36.67 mg/L。27 h时后GSH与菌体量同时下降，可能由于发生菌体自溶导致GSH质量浓度降低。

图1 面包酵母CICC1447 GSH常压发酵曲线Fig.1 Fomentation curve of GSH under atmospheric pressure of Saccharomyces cerevisiae CICC1447

2.2 保压时间对GSH合成的影响

以高纯空气（O2∶N2=21∶79）为加压介质，在发酵20 h时以0.05 MPa/min速率将压力升到1.0 MPa，研究保压时间对GSH生物合成量的影响，空白对照为常压发酵见图2。

图2 保压时间对面包酵母CICC1447 GSH合成的影响Fig.2 Effect of holding time on the synthesis of GSH of Saccharomyces cerevisiae CICC1447

图3 保压时间对面包酵母CICC1447的影响Fig.3 Effectofholdingtimeon SaccharomycescerevisiaeCICC1447

由图2可以看出，在1.0 MPa压力下处理时间6 h后，酵母胞内积累GSH的质量浓度达到最大值42.86 mg/L，较常压发酵提高了15.36%。保压9 h的处理组GSH合成量低于保压6 h的处理组。

由图3可知，随着保压处理时间的延长，酵母菌细胞的存活率由100%（0 h）下降到85.67%（9 h），加压6 h后菌体量也有所下降。这可能是酵母细胞在长时间受到压力刺激后，细胞膜通透性发生改变，导致胞内代谢发生变化甚至因细胞膜的破损而自溶。GSH作为应激性反应的主要代谢产物，在菌体受到压力刺激时，为了维持正常的代谢活动，菌体产生应激反应开始大量积累GSH。但随着保压时间延长，菌体存活率下降，可能部分菌体细胞破碎，从而使GSH浓度反而降低。

2.3 压力对GSH合成量的影响

在20 h时以升降压速率为0.05 MPa/min将压力分别升到 0.5、1.0、1.5、2.0 MPa，选择保压时间 6 h 进行发酵，结果见图4。

图4 压力对面包酵母CICC1447 GSH合成的影响Fig.4 Effect of pressure on the synthesis of GSH of Saccharomyces cerevisiae CICC1447

当压力为0.5 MPa时，GSH浓度较对照组提高17.03%，但随着压力的进一步增加，GSH浓度开始下降，当压力超过1.5 MPa后，GSH浓度迅速下降。图5证明压力大小对面包酵母细胞存活率、菌体量的影响较大，随着压力的升高，当压力超过1.0 MPa时，酵母菌的存活率迅速下降，由0.5 MPa时的98.23%下降到2.0 MPa时的62.45%。菌体在低压条件下，为了应对压力刺激，促进了GSH的积累，但当压力超过菌体承受极限，代谢出现紊乱，使存活细胞中应激代谢产物含量降低[17]，单位质量细胞生产的GSH开始下降，另一方面大量细胞开始破碎，细胞总量降低，也加速了GSH产量的降低。因此确定0.5 MPa为酵母菌积累GSH的最佳压力条件。

图5 压力对面包酵母CICC1447的影响Fig.5 Effect of pressure on Saccharomyces cerevisiae CICC1447

2.4 升降压速率对GSH合成量的影响

在上述最优条件下，以升降压速率分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 MPa/min 进行实验，从图 6 可以看出，当升降压速率在0.10 MPa/min以下时，升降压速率对积累合成GSH的影响不大。但当升降压速率大于0.10 MPa/min时，GSH的浓度随升降压速率的增大而减小。升降压速率会对细胞存活率和菌体量产生影响（图7）。细胞存活率和菌体量在升降压速率为0.05 MPa/min～0.10 MPa/min时变化不大，随着升降压速率提高，细胞存活率迅速下降。

图6 升降压速率对面包酵母CICC1447 GSH合成的影响Fig.6 Effect of pressurization and depressurization rates on the synthesis of GSH of Saccharomyces cerevisiae CICC1447

图7 升降压速率对面包酵母CICC1447的影响Fig.7 Effect of pressing and depressing rates on Saccharomyces cerevisiae CICC1447

升降压速率对GSH合成影响的主要原因在于菌体对压力变化速率的适应能力。升降压速率小，菌体有足够的时间来调节以适应压力变化，升降压速率过大后，菌体难以快速调节自适应系统使内外压力平衡，导致细胞死亡[18]。说明在升降压速率较低时酵母细胞可以通过自身调节适应压力变化[19]。升降压速率的变化在影响细胞存活率及细胞量的同时，也会改变菌体产生的应激性反应，升降压速率较低时促进GSH的积累，当升降压速率过大，菌体难以快速平衡内外压力而破裂死亡，进而影响了GSH的积累。

2.5 温和压力下PI与酵母胞内DNA结合产生的荧光强度变化

为证明压力是否造成细胞膜结构破坏，将常压下培养20 h的酵母CICC1447细胞于1.0 MPa、N2为加压介质条件下分别处理1 h和3 h，以常压处理为对照样，利用流式细胞术分析压力处理样品与对照样品PI荧光强度变化，结果表1。

表1 不同压力及时间下面包酵母CICC1447荧光强度的比较Table 1 Comparison of fluorescence intensities of Saccharomyces cerevisiae CICC1447 cells under different pressure and time

从表1显示常压对照组面包酵母CICC1447细胞1 h和3 h的细胞荧光强度分别为2.32和2.58。而在1.0 MPa下保持1 h和3 h，细胞荧光强度分别增加至2.47和2.93，较常压对照组分别提高了6%和13.56%。PI主要是与细胞核中的DNA结合产生荧光，其不能进入细胞膜完整的活细胞，当细胞死亡后细胞膜破损，PI可进入细胞与DNA结合，进而产生荧光信号。长时间压力处理对细胞影响较大，一方面压力处理可刺激细胞GSH产量的提高，但如果压力时间过长会破坏细胞膜结构，进而造成细胞死亡，从而降低GSH产量。

3 结论

以面包酵母CICC1447为研究对象，研究了不同的保压时间、压力、升降压速率及加压前培养时间对GSH生物合成量的影响，确定了保压时间6 h、压力0.5 MPa、升降压速率 0.05 MPa/min～0.10 MPa/min，GSH产量较常压提高了17.21%。流式细胞仪结果表明，温和压力短时间处理可刺激细胞的应激反应，提高GSH产量，但当较高压力长时间处理后，细胞膜破碎，细胞死亡，会降低GSH产量。

说明利用加压作为胁迫条件在一定条件下可以提高应激产物GSH的生物合成能力，这对提高谷胱甘肽产量有一定的指导意义。可以继续研究压力作用下GSH合成酶系酶活的变化，以便更深入地探讨加压应激反应作用机理。

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