陈建兴，陈海伟，毕晓丹，王银朝，雷战

（1.赤峰学院生命科学学院，内蒙古 赤峰 024000；2.山东东阿阿胶股份有限公司，山东 聊城 252201）

驴CSN3基因序列分析

陈建兴1，陈海伟1，毕晓丹1，王银朝2，雷战2

（1.赤峰学院生命科学学院，内蒙古 赤峰 024000；2.山东东阿阿胶股份有限公司，山东 聊城 252201）

陈建兴,男,1980年出生于山西省运城市芮城县,1999年考入西北民族大学就读动物科学专业。2006年考入青岛农业大学动物科技学院攻读动物遗传育种与繁殖专业硕士，2009年获农学硕士学位。同年考入内蒙古农业大学动物科学学院攻读动物遗传育种与繁殖专业博士学位，师从双博士芒来教授。2012年获农学博士学位。主要研究方向为动物分子遗传学。

家驴具有很大的市场开发潜力和价值.本研究通过生物信息学技术分析了家驴CSN 3基因的序列特征，为家驴向肉用或乳用方向选育初步提供一定的分子依据.经分析研究发现家驴CSN 3基因共包含五个外显子和四个内含子.初始转录物的前81nt为5'UTR区，后205nt为3'UTR区，中间的549nt为CDS区.整个CDS区翻译出182个氨基酸构成的多肽.家驴的κ酪蛋白中的氨基酸以脯氨酸所占的比例最高（14.286%），其次为缬氨酸（10.989%），最低的为半胱氨酸、色氨酸和甘氨酸（所占比例都为0.5495%）.各物种κ酪蛋白氨基酸序列间每个位点氨基酸替代数的平均值的大小能够较好反映物种间亲缘关系的远近.κ酪蛋白氨基酸序列能够很好地反映物种之间的亲缘关系，适合用于系统发育分析.

驴；CSN 3基因；κ酪蛋白；序列分析

家驴（Equus asinus）是人类大约6,000年前从非洲野驴（Equus africanus）的一个或者两个亚种驯化而来的[1,2].随后，在许多文化体系中，家驴一直作为主要的驮运家畜为人类文明的发展做出了巨大贡献.时至今日，家驴和骡子在许多贫穷并且气候干旱的地区仍是运输重物、人员和财物的主要驮畜[3].但随着农业机械化和交通运输业的快速发展，在发达国家以及一些国家的发达地区，家驴这样的驮运动物已被淘汰，这就导致不仅个别品种消失，而且家驴该物种整体也出现种质退化和种群数量下降的趋势[4].我国家驴的养殖数量一直居世界之首[4,5]，家驴的种质资源退化状况与世界范围内的整体局势相似[5].

在哺乳动物中，CSN3基因编码的κ酪蛋白是乳中的主要蛋白成分之一[6]，并且，该蛋白成分决定乳微粒的大小（乳微粒能增加矿物质的溶解度并协助营养物质从母体传递到幼体）和特定功能（κ酪蛋白被凝乳酶分解的产物负责乳凝结）[7].一般情况下，CSN3基因包括5个外显子，并且第4外显子编码成熟蛋白中的160～169个氨基酸.第四外显子编码的多肽链长度占整个成熟蛋白的85%左右.赵春江等发现CSN3基因与中国荷斯坦牛乳蛋白率含量有显著相关[8].蓝贤勇等的研究发现，CSN3基因对奶山羊产羔数有显著影响[9].Hobor等（2006）[10]鉴定了三个家马品种CSN3第一和第四外显子上的各两个SNP位点，随后，又对马属动物该基因的启动子区和第四外显子区序列进行了比较分析[11]. Selvaggi等[12]研究了Murgese马CSN3第一外显子两个位点的遗传多态性.

对于家驴CSN3基因的研究，只是在Hobor（2008）的研究[11]中附带与家马和斑马的部分相应序列做了比较分析，并未见到专门的研究报道.为此，本研究通过生物信息学技术初步分析家驴CSN3基因的序列特征，为家驴向肉用或乳用方向选育提供科学参考，为我国家驴的遗传改良提供分子依据.

1 材料与方法

1.1 数据来源

所使用的CSN3基因序列，全部来自GenBank.家驴、家马、家猫、虎鲸、骆驼、狒狒、人、猪、绵羊、牛、兔、褐鼠和家鼠的GenBank登录号分别为：FR822990、NM_001081884、XM_003985304、XM_00 4268339、HE863813、XM_003898807、NM_005212、NM_001004026、NM_001009378、NM_174294、NM_ 001082625、NM_031562和NM_007786.

1.2 分析方法

序列间每个位点的氨基酸替代分析采用泊松矫正模型来进行.各物种κ酪蛋白氨基酸组成分析、进化分歧估计和进化树构建通过MEGA5来完成.

2 结果及分析

2.1 家驴CSN3基因基本构成

家驴CSN3基因的外显子和内含子的大小构成情况参见图1.从图中可见，家驴CSN3基因共包含五个外显子和四个内含子.前三个外显子都非常小，第四外显子序列长度占整个初始转录物长度的59.4%.根据GenBank上登录的信息（登录号为FR822990），该初始转录物的前81nt为5'UTR区，后205nt为3'UTR区，中间的549nt为CDS区.整个CDS区翻译出182个氨基酸构成的多肽.多聚腺苷酸（polyA）信号位于第五外显子的末端.

图1 家驴CSN3基因基本结构模式图白色框表示外显子，灰色框代表内含子.

2.2 家驴κ酪蛋白氨基酸组成分析

通过对家驴等13个物种的κ酪蛋白氨基酸组成进行分析发现，氨基酸序列长度以褐鼠的最小（178），绵羊的最大（192），而一半左右物种（包括驴、人、虎鲸、家猫、骆驼和狒狒）的长度为182.从氨基酸组成情况来看，由于狒狒与人的亲缘关系最近，固然二者应该最为相似.但家驴与人的κ酪蛋白六种氨基酸（半胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺和精氨酸）的比例（依次为0.5495%、1.6484%、0.5495%、1.0989%、6.044%和4.3956%）惊人地一致，这在这些物种（除狒狒外）中是绝无仅有的.家驴的κ酪蛋白中的氨基酸以脯氨酸所占的比例最高（14.286%），其次为缬氨酸（10.989%），最低的为半胱氨酸、色氨酸和甘氨酸（所占比例都为0.5495%）.

2.3 κ酪蛋白氨基酸序列进化分歧估计

表1中显示的是各物种κ酪蛋白氨基酸序列间每个位点氨基酸替代数的平均值，从中可以看出，该值的最小值为驴和马之间的0.034±0.013，其次为人和狒狒间的0.080±0.020.绵羊和牛也比较小，为0.159±0.030.可以看出，分歧的大小能够较好反映物种间亲缘关系的远近.驴和人氨基酸序列之间的每位点的平均替代数为0.411±0.052. 2.4κ酪蛋白氨基酸序列系统发育分析

基于泊松矫正模型，采用最大似然法构建了13个物种κ酪蛋白氨基酸序列的系统发育关系，结果见图2.通过自展法（1000次重复）对系统发育树各分支之间的聚类关系进行了评价，自展值显示在分支上.从图2可以看出，啮齿目的褐鼠和家鼠、灵长类的人和狒狒以及马属动物的驴和马都分别100%地聚在了一起，绵羊和牛这两个反刍动物也97%都聚在了一起.另外，虽然有些分支自展值不是很高，比如，猪和骆驼聚在一起，再与绵羊和牛的分支聚在一起，这四种偶蹄动物聚在了一起，也反映出了一定的系统发育关系.说明κ酪蛋白氨基酸序列能够很好地反映物种之间的亲缘关系，适合作为系统发育分析的材料.

表1 序列间进化分歧估计

图2 最大似然法构建的系统发育树

3 讨论与结论

在反刍动物中，对于CSN3基因的研究比较多见[8,9]，并且也都对该基因的多态与生产性状进行了关联分析.而对于马属动物，只是偶见对家马CSN3基因的启动子区和第一、第四外显子的遗传多态性进行了调查[10～12]，并未见到更进一步的研究报道.对于家驴CSN3基因的研究报道，更是接近空白.虽然CSN3主要是在乳中表达的一个基因，蓝贤勇等的研究发现，CSN3基因对奶山羊产羔数有显著影响[9].对于家驴来说，该基因的多态有无，多态对生长和产乳有无影响，都还是未知的.可见，未来对此基因的研究具有很大的意义，有可能找到对家驴开发利用有价值的分子标记位点.因此，本研究通过生物信息学技术初步分析家驴CSN3基因的序列特征，为将来探寻该基因的多态性打下基础.

由家驴等物种的κ酪蛋白氨基酸组成分析结果可以看出，家驴与人的六种氨基酸（Cys、Asp、Gly、Met、Asn和Arg）在κ酪蛋白中所占的比例完全一致，这在除狒狒外的物种中是仅有的.可见，在该酪蛋白的组成上，驴与人比较接近.考虑到κ酪蛋白是乳中的一种主要蛋白，我们也支持张晓莹等在对驴乳的化学成分进行分析的基础上，提出的驴乳相比牛乳或羊乳更适合作为母乳的替代物的观点[13].

家驴CSN3基因共包含五个外显子和四个内含子.初始转录物的前81nt为5'UTR区，后205nt为3'UTR区，中间的549nt为CDS区.整个CDS区翻译出182个氨基酸构成的多肽.家驴的κ酪蛋白中的氨基酸以脯氨酸所占的比例最高（14.286%），其次为缬氨酸（10.989%），最低的为半胱氨酸、色氨酸和甘氨酸（所占比例都为0.5495%）.各物种κ酪蛋白氨基酸序列间每个位点氨基酸替代数的平均值的大小能够较好反映物种间亲缘关系的远近.κ酪蛋白氨基酸序列能够很好地反映物种之间的亲缘关系，适合用于系统发育分析.

〔1〕A.Beja-Pereira,P.R.England,N.Ferrand,et al.African origins of the domestic donkey[J].Science,2004,304(5678):1781.

〔2〕S.Rossel,F.Marshall,J.Peters,et al.Domestication of the donkey:timing,processes,and indicators[J].Proceedings of the National A-cademy of Sciences of the United States of America,2008,105(10):3715-3720.

〔3〕P.Starkey.The Origins and Development of African Livestock:Archaeology,Genetics,Linguistics and Ethnography[M].London:University College London Press,pp.478–502,2000.

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〔13〕张晓莹,赵亮,郑倩,等.新疆疆岳驴乳理化和微生物指标分析[J].食品科学,2008,29(01):303-305.

Q523

A

1673-260X（2014）07-0011-03

本文系陈建兴主持2013年度内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZC13306）研究成果