张玉洁，吴 倩，廉 果

去甲斑蝥素抑制人脑胶质瘤细胞增殖的体内外研究

张玉洁，吴 倩*，廉 果

目的 研究去甲斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)体内外对人脑胶质瘤细胞的抑制作用。方法 常规培养细胞，24 h后随机分为阳性对照组、空白对照组和去甲斑蝥素6个剂量组，MTT法检测NCTD对人脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用；流式细胞术检测细胞凋亡率；建立SHG-44细胞裸鼠异种移植瘤模型，将荷瘤裸鼠随机分为阴性对照组、顺铂阳性对照组以及NCTD 3个剂量组，腹腔注射给药12 d后，取血检测血常规及肝肾功能；处死裸鼠，剥瘤称重并计算抑瘤率。结果 NCTD 6个剂量组显著抑制SHG-44细胞的增殖，且呈时间和剂量依耐性；并提高SHG-44细胞的凋亡率；NCTD 3个剂量组可抑制SHG-44细胞裸鼠异种移植瘤的生长，对移植瘤裸鼠血常规及肝肾功能无明显影响。结论 NCTD体内外均可抑制SHG-44细胞生长，并诱导肿瘤细胞凋亡。

去甲斑蝥素；SHG-44细胞；增殖；凋亡；裸鼠

0 引言

脑胶质瘤可导致患者出现致残和脑功能缺失表现，死亡率很高。而目前临床上对脑胶质瘤有效的化疗药物又很少，主要以放射治疗和手术治疗为主[1]。斑蝥素是一种广泛应用于临床的抗肿瘤中药，但因其具有强烈的泌尿系统刺激作用而限制了其使用。将斑蝥素去除1、2位2个甲基得去甲斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)，其药理活性与斑蝥素相当，但毒副作用降低[2]。NCTD是新型的抗肿瘤中药，具有较强的抗肿瘤活性和独特的升白细胞功能[3]，是国际上第一个有升高白细胞作用的抗癌药物，主要用于治疗肝癌、食管癌和胃癌，而其对人脑胶质瘤SHG-44细胞的影响尚不清楚。本实验检测了NCTD体内外对SHG-44细胞的影响，为NCTD治疗人脑胶质瘤的临床用药提供了理论依据。

1 材料、试剂和仪器

人脑胶质瘤SHG-44细胞由华中科技大学同济医学院提供；SPF级BALB/C-nu裸鼠，体重16～20 g，购于中国医学科学院上海实验动物繁殖中心，按SPF级要求管理；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；RPMI 1640培养粉(Gibco公司)；顺铂(江苏豪森药业股份有限公司)；MTT和胰蛋白酶(Sigma公司)；ELx800型酶联免疫检测仪(BIO-TEK公司)；CO2孵箱(JOUAN公司)；流式细胞仪FACS Calibur(Becton Dickinson公司)；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 MTT法检测NCTD对人脑胶质瘤细胞生长的抑制作用 常规培养人脑胶质瘤SHG-44细胞，待细胞贴壁生长状态良好时，以1×105/mL密度接种于96孔培养板中，于5% CO2、37 ℃孵箱中预培养24 h后，分别加入不同浓度的NCTD，使最终每组含NCTD浓度分别为：10、20、40、80、160、320 μg/mL，每个浓度6个复孔，并设阳性对照药顺铂组和正常细胞组，继续培养。分别于48、72、96 h 3个时相各取出一块96孔板进行MTT比色实验：每次于实验结束前每孔加入MTT，继续培养4 h后，按常规采用酶标仪(波长570 nm)测定各孔吸光度值(A)。按公式“(1-药物孔A值/对照孔A值)×100%”计算细胞抑制率，以剂量和生长抑制率作直线相关分析。

2.2 流式细胞术检测对细胞凋亡的影响 将SHG-44细胞以1×106/mL密度接种于培养瓶中，24 h后随机分组，分别加入不同浓度的NCTD或阳性对照药顺铂，对照组加入等体积的1640培养液，继续培养48 h，常规消化洗涤细胞后，用70%预冷乙醇固定细胞，置4 ℃环境待测凋亡率。检测前，先离心弃上清，再用PBS洗涤后置于柠檬酸缓冲液中1 h以上，调整细胞浓度至1×106/mL左右，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.3 体内抑瘤实验 裸鼠皮下移植瘤模型的建立：将约1×107个SHG-44胶质瘤细胞接种于BALB/C-nu裸鼠右腋皮下，致瘤后，无菌条件下以组织块移植传代，4代后生物学特征稳定。以无菌技术取出皮下移植瘤，剪切后，按2 mm3/鼠用套管针接种于裸鼠右腋皮下，待肿瘤生长至约100 mm3时，将荷瘤鼠随机分为5组：正常组、顺铂(20 mg/kg)阳性对照组、NCTD(25、50、100 mg/kg)3个剂量组，每组10只。正常组每日给生理盐水灌胃，顺铂和NCTD组采用腹腔注射方式给药，每次0.2 mL，皆连续给药12 d。

2.3.1 体重、血常规及肝、肾功能的检测 末次给药后24 h，对裸鼠行体重称量后，每只腹腔注射0.5%肝素0.5 mL，使之肝素化，5～6 min后摘除眼球取血，一部分肝素抗凝全血用以检测血常规中白细胞(leukocyte，Leu)、血红蛋白(haemoglobin，Hb)和血小板(platalet，Plt)的浓度；另一部分离心分离出血浆，用以检测肝功能中丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、γ-谷氨酰转移酶(γ-glutamyltransferase，γ-GT)和肾功能中血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)的浓度。

2.3.2 抑瘤率的检测 取血后，颈椎脱臼处死裸鼠，立即完整剥离瘤块，称量瘤块重量，计算各组平均瘤块重量及抑瘤率。抑瘤率(%)=[1-(给药组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重)]×100%。

3 结果

3.1 NCTD对SHG-44细胞生长的抑制作用 置显微镜下观察，NCTD作用后的细胞排列稀疏，随作用时间延长和药物浓度的增加细胞密度逐渐减少。MTT实验结果显示，各剂量组NCTD对SHG-44细胞的增殖均有一定的抑制作用，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，抑制率增加，NCTD对SHG-44细胞的抑制作用具有统计学意义。见图1。

图1 NCTD对SHG-44细胞增殖的抑制作用

3.2 NCTD对SHG-44细胞凋亡的影响 各浓度NCTD作用于SHG-44细胞后的细胞凋亡率明显高于对照组，且随着剂量的增加，细胞凋亡率明显增加，并出现凋亡典型性特征峰。见表1。

表1 NCTD对SHG-44细胞凋亡的影响

注：与细胞对照组比较，*P<0.001

3.3 NCTD对荷瘤裸鼠血常规、肝肾功能和体重的影响 腹腔注射给药12 d后，阳性对照组荷瘤裸鼠的白细胞数为(8.1±1.8)×109/L，明显低于阴性对照组(11.7±2.3)×109/L(P<0.05)；而NCTD 3个给药组血常规、肝肾功能以及体重的检测结果与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 荷瘤裸鼠的血常规、肝肾功能和体重检测结果

注：与阴性对照组比较，*P<0.05

3.4 NCTD对荷瘤裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用 腹腔注射NCTD 12 d后，处死各组裸鼠，取瘤块称重的结果显示，高、中、低3个剂量组瘤块重量均明显低于阴性对照组(P<0.05或P<0.001)，抑瘤率分别为50.40%、34.86%和19.71%，呈现剂量依赖性，提示NCTD对SHG-44细胞裸鼠异种移植瘤的生长具有明显的抑制作用，结果见表3。

表3 给药12 d后各组瘤块质量及抑瘤率比较

注：与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

4 讨论

胶质瘤是颅内最为常见的原发性恶性肿瘤，发病率占颅内肿瘤的44%。胶质瘤多浸润性生长，手术很难将颅内侵袭灶完全切除。目前多采用手术、化学治疗或放射治疗联合治疗，最大限度杀伤肿瘤细胞是胶质瘤综合治疗中的重要环节[4-9]。多数胶质瘤对放射线不敏感，化疗药物又难以透过血脑屏障，目前尚缺乏满意的治疗手段，因此，如何有效地控制甚至治愈胶质瘤仍是亟待解决的难题。去甲斑蝥素不仅具有显著的抗癌作用，且毒性作用较小，同时具有上调白细胞、保护肝细胞、调节免疫功能等作用，在抗肿瘤方面有着不容忽视的作用。

抑制肿瘤细胞的增殖和促进肿瘤细胞的凋亡是肿瘤防治的关键手段之一。细胞凋亡又称程序性死亡(Programmed cell death)，是生物体为了除去多余、损伤或感染的细胞而进行的主动自杀行为[10]。凋亡不仅直接影响着机体组织的正常发育、分化与死亡，其在肿瘤治疗中的作用也已受到极大的重视[11-12]。

本研究发现，NCTD能够有效地杀伤SHG-44细胞，抑制其增殖，细胞抑制率呈浓度、时间依赖性，且显微镜下观察细胞形态发生明显的改变。流式细胞仪检测发现，NCTD还可诱导SHG-44细胞凋亡，且随着浓度的增大，细胞凋亡率增加，与对照组比较差异有统计学意义，表明NCTD可通过诱导SHG-44细胞凋亡而抑制其增殖。裸鼠异种移植瘤模型是人们进行肿瘤实验性治疗广泛采用的研究手段，人体内肿瘤与人肿瘤细胞裸鼠异种移植瘤对药物反应的一致性已获得证实[13]。

本实验结果显示，对建立的SHG-44细胞裸鼠异种移植瘤行腹腔注射方式给药12 d后，高、中、低3个剂量组的NCTD抑瘤率分别达到50.40%、34.86%和19.71%，提示NCTD具有明显的体内抗人脑胶质瘤活性，且作用呈现剂量依赖性。

药物浓度超过一定范围会带来毒副作用，通常表现在对胃肠道、造血系统及肝肾功能的影响上。本研究在给药12 d内观察移植瘤裸鼠一般状况，高、中、低3个剂量NCTD给药组均未见裸鼠有消瘦、厌食、活跃程度下降等明显异常；给药12 d后的血常规和肝肾功能检测结果显示，3个浓度NCTD给药组和阴性对照组比较差异均无统计学意义，提示在本研究的给药剂量下，NCTD对SHG-44细胞具有选择性杀伤作用，而对裸鼠正常血细胞和肝、肾器官无明显毒副作用。相比之下，阳性对照组荷瘤裸鼠的白细胞数明显低于阴性对照组，推测与顺铂具有一定的骨髓抑制性有关。

肿瘤的形成和发展是极其复杂的过程，涉及多个细胞因子及凋亡通路，在治疗后期仅依靠去甲斑蝥素抑制恶性胶质瘤难以取得有效的成果，若将其与其他化疗药联合应用，能否有效控制肿瘤生长，减少耐药性，值得进一步研究。

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Inhibition effect on human gliomas cell of norcantharidininvivoandinvitro

ZHANG Yu-jie,WU Qian*,LIAN Guo

(Xiangyang Central Hospital,Xiangyang 441021,China)

Objective To study the inhibition effect on human gliomas of norcantharidin (NCTD)invivoandinvitro.Methods Cells were cultivatedinvitro,and then were divided into positive control group,negative control group and NCTD six doses groups randomly after being cultured for 24 h.The cytostatic effect of NCTD on human gliomas was evaluated by MTT assay.Flow cytometry was utilized for measuring the apoptosis.The nude mice with SHG-44 cell xenografts were treated with drugs via intraperitoneal injection daily,and were divided into 5 groups:negative control group,positive control group,NCTD three doses groups.After 12-day treatment,blood routine,liver and kidney function were detected.Results NCTD inhibited cell growth in a concentration and time-dependent manner.And the apoptosis rates were elevated.NCTD remarkably inhibited the growth of SHG-44 cell xenografts,no significant effect was found on nude mice blood,liver and kidney function.Conclusion NCTD can inhibit the growth of SHG-44invitroandinvivo,and induce SHG-44 apoptosis.

NCTD;SHG-44;Proliferation;Apoptosis;Nude mice

2013-06-26

湖北襄阳市中心医院，湖北 襄阳 441021

*通信作者