王烨珣，何 娟

多索茶碱对体外U937细胞增殖与诱导凋亡的影响

王烨珣1，2，何 娟1

目的探讨磷酸二酯酶抑制药多索茶碱对体外培养的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)细胞U937增殖及凋亡的影响。方法分别将不同实验浓度的多索茶碱作用于一定浓度的处于对数生长期的U937细胞，采用WST-1方法检测细胞增殖抑制率，TUNEL法检测细胞凋亡。结果不同浓度的多索茶碱分别作用于U937细胞后，细胞增殖活性受抑程度随着作用时间的延长和药物浓度的增加而逐渐增加(P<0.01)，其中以60 mg/L组最明显。不同浓度的多索茶碱均能促进U937细胞凋亡，且凋亡具有显著的浓度依赖性及时间依赖性(P<0.01)。结论多索茶碱能够抑制白血病细胞U937细胞株增殖，诱导其凋亡，并具有浓度及时间依赖性。

多索茶碱；髓系白血病；U937细胞；细胞增殖与凋亡

诱导细胞凋亡是一些化疗药物杀灭白血病细胞的主要机制[1-3]。多索茶碱属于磷酸二酯酶抑制药(PDE)，国内外均有研究提示茶碱类药物有诱导肿瘤细胞凋亡的作用[4-7]。本研究拟将多索茶碱作用于U937细胞，观察对其增殖及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂与仪器 多索茶碱(开封康诺药业公司生产，应用时配至实验所需浓度)；WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒，一抗。SP试剂盒、DAB显色试剂盒。TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒及FITC绿色荧光标记。光学显微镜，酶联免疫检测仪。数码显微镜(OLYMPUS BX41型)，生物显微镜(CHA型)，Leica Q550CW图象采集和分析系统(德国莱卡公司)，微量移液器。脱水机(LEICA300型)，石蜡包埋机(EG1150型)，切片机(LEICA RM2235型)。

1.2 细胞系及细胞培养 人-粒单核性白血病细胞株U937购自中国医科大学血液室，将购入后的U-937细胞置于培养液常规饲养，每日更换新鲜培养液，隔日传代。实验对象为对数生长期的细胞。

培养液配置：无菌的RPMI1640培养液500 ml，加入胎牛血清(无菌 ，去除支原体)50 ml，加入青霉素浓度为10 000 U/ml和链霉素浓度为10 mg/ml的混合液5 ml。混匀后，分装至100 ml的试剂瓶中，4 ℃冰箱中冷藏保存备用。

1.3 WST-1法检测多索茶碱对细胞增殖活性的影响 取对数生长期细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为(3～5)×104/ml，将待测细胞吹匀后接种于96孔板，每孔90 μl，然后分别加入多索茶碱液10 μl，其实验终浓度分别设5.0、10.0、15.0、30.0、60.0 mg/L，另设空白对照孔。每个浓度设定10个复孔，空白对照组只加含10%小牛血清的RPMI1640，将各组分别在培养箱中常规培养12 h及24 h。取出培养后的培养板，每孔加WST-1溶液10 μl混匀，37 ℃再培养2 h，将培养板取出，在酶联免疫检测仪上选择450 nm和 620 nm波长，分别测定每孔的吸光度值，相减后得到调整后的OD450，再用无细胞孔校正。

1.4 TUNEL法检测多索茶碱对细胞凋亡的影响 (1)培养步骤同上，取细胞对数生长期细胞，进行药物干预,以5×104/ml的细胞浓度接种于瓶内，分别加入多索茶碱溶液500 μl，其实验终浓度分别设为10.0、20.0、30.0 mg/L，对照组不加，各组分别于培养12 h及24 h时分别收集细胞制备涂片用于凋亡检测。(2)将固定好的细胞涂片以下述流程处理：PBS漂洗两次，样本周围用吸水纸吸干，每个样本加50 μl TdT酶反应溶液，加盖玻片37 ℃避光湿润反应60 min(TdT酶反应溶液：45 μl Equilibration Buffer+1μl FITC-12-dUTP+4 μl TdT Enzyme,需新鲜配制)，阴性对照片不加TdT酶，PBS漂洗3次，荧光显微镜检测：激发波450～500 nm ,发射波长515～565 nm(绿)。(3)荧光显微镜观察细胞凋亡的形态，结果判断：在清晰的背景上细胞呈黄绿色为阳性。每张片子连续选取5个互不重叠的视野，计数每个视野中的阳性细胞数，以平均数记为该片阳性细胞凋亡数。

2 结 果

2.1 多索茶碱对U937细胞的增殖抑制作用 空白对照组细胞增殖活性(OD值)为0.404±0.016，不同浓度的多索茶碱分别作用于U937细胞12 h及24 h后，细胞增殖活性受抑程度随着作用时间的延长和药物浓度的增加而逐渐增加(P<0.01)，其中以60 mg/L作用24 h组最明显(表1)。

表1 多索茶碱浓度、作用时间与细胞增殖活性(OD值)检测结果的关系 (n=10；

2.2 多索茶碱对U937细胞凋亡的影响 WST-1法与TUNEL法所观察结果一致，空白对照组凋亡阳性细胞数为(7.8±1.3)个，3组不同浓度的多索茶碱作用12 h及24 h均能促进U937细胞凋亡，且凋亡具有显著的浓度依赖性(P<0.01)及时间依赖性(P<0.01)，见表2。凋亡检测结果见图1。

表2 多索茶碱浓度、作用时间与细胞凋亡检测结果的关系 (n=5；

图1 多索茶碱作用后电镜下细胞凋亡状况(FITC，×200倍)

3 讨 论

近年来,随着联合化疗的应用及有效化疗方案的不断改进和完善，成人急性白血病的完全缓解率可达70%以上，但其长期生存率只有10%～40%[1，2]。研究表明, 各种白血病的发生及其对治疗的反应可能均和白血病细胞凋亡的减少有关，这也成为如何通过诱导白血病细胞的凋亡来治疗白血病的重要着力点。Li等[3]在对白血病细胞系的研究中发现，白血病细胞的增殖与凋亡在病理状态下稳定在一定比例上, 如何破坏这种比例加速白血病细胞凋亡将成为筛选和寻找新的化疗药物的重点。近年来国内外均有研究提示，茶碱类药物有诱导细胞凋亡的作用。如Binet等[4]发现氨茶碱能诱导慢性淋巴细胞白血病患者B淋巴细胞凋亡；刘泽林等[5]报道磷酸二酯酶抑制药对淋巴瘤细胞有生长抑制及诱导细胞凋亡作用；赵兰滨等[6]报道氨茶碱诱导白血病K562细胞凋亡；罗亚玲等[7]报道氨茶碱能诱导人气管平滑肌细胞凋亡。多索茶碱亦属于茶碱类药物，其对肿瘤细胞的作用未见相关报道。

磷酸二酯酶抑制药多索茶碱是第二信使分子(cAMP)环核苷酸信号灭活的关键酶，可调控体内cAMP浓度，进一步激活其效应分子蛋白激酶A(PKA)，降低细胞生长的速度，抑制细胞的增殖，同时还可通过激活核酸内切酶诱导细胞凋亡[8]。多索茶碱还具有增加儿茶酚胺，调节钙流及拮抗腺苷受体作用[9]，钙离子同属细胞内信息传递的第二信使，能够通过钙离子蛋白受体CaM调整cAMP代谢，促进细胞内的cAMP累积而进入cAMP-PKA通路，诱导细胞凋亡。除此以外，茶碱类药物还可通过下调bcl-2[10],上调p53[11]及fas[12]诱导细胞凋亡。

本实验结果表明，不同浓度的多索茶碱分别作用于U937细胞12 h及24 h后，细胞增殖活性受抑程度及凋亡随着作用时间的延长和药物浓度的增加而呈现明显的浓度依赖性及时间依赖性。多索茶碱是目前临床应用比较成熟的药物，其不良反应及机体的耐受能力均远优于氨茶碱，兼具经济性和安全性，本实验结果提示该药可以作为白血病治疗的辅助药物，并为其他类似药物作用的拓展研究提供思路。

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(2014-03-22收稿 2014-05-05修回)

(责任编辑 尤伟杰)

DoxofyllineinhibitesU937cellsproliferationandinducesapoptosisinvitro

WANG Yexun1,2and HE Juan1.

1.Department of Hematology,The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, China; 2. Department of Medicine, Liaoning Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Shenyang 110034, China

ObjectiveTo study the effects of the inhibitors of phosphodiesterase for acute myeloid leukemiainvitroculture U937 cell proliferation and apoptosis ,and provide basis for the clinical adjuvant treatment of leukemia.MethodsAdd Doxofylline of different experimental concentrations was added respectively to a certain concentration of U937 cells in ogarithmic phase. Cell proliferation rate was detected by WST-1 method and the apoptosis by TUNEL method.ResultsDifferent concentrations of doxofylline acted on U937 cells respectively. The degree of inhibition of cell proliferative activity gradually increased with prolonged action time and the increase of drug concentration(P<0.01), the most obvious among them was in 60 mg/L group. Different concentrations of doxofylline promoted U937 cell apoptosis and apoptosis with significant concentration dependence and time dependence(P<0.01).ConclusionsConfirmed by the experiment, doxo fylline can inhibit leukemia U937 cell line proliferation and induce its apoptosis,and has concentration dependence and time dependence.

doxofylline; acute myeloid leukemia; U937 cells; apoptosis and inhibition

王烨珣，硕士，主治医师,E-mail: wang-y-x@163.com

1.110001沈阳，中国医科大学附属第一医院血液科；2.110034沈阳，武警辽宁总队医院门诊部

何 娟，E-mail：hejuan 2006@aliiun.com

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