高现亮，罗华元，梅友坤，董石飞 ，罗 艺，饶 智，钟永丽，兰建强,3**

(1.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201；2.红云红河烟草(集团)有限责任公司，云南 昆明 650231；3.云南农业大学 烟草学院，云南 昆明 650201)

〈生理生化〉

多种食用菌粗提液对烟草病原菌的抑制效果*

高现亮1，罗华元2，梅友坤1，董石飞2，罗 艺1，饶 智2，钟永丽1，兰建强1,3**

(1.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201；2.红云红河烟草(集团)有限责任公司，云南 昆明 650231；3.云南农业大学 烟草学院，云南 昆明 650201)

研究了11种食用菌水提液对异丝腐霉、黑胫病菌和青枯病病菌生长的抑制作用。取红葱、香菇、木耳、块菌、黑牛肝、黄牛肝、美味牛肝菌、大红菇、奶浆菌、青头菌和虎掌菌等粉末分别与蒸馏水混合后搅拌破碎，采用0.45 μm微孔滤膜过滤和真空抽滤泵进行抽滤，得到无菌提取液，对异丝腐霉、黑胫病菌和青枯病菌3种烟草病原菌的抑菌活性进行了测试。结果表明,11种食用菌提取液对3种供试菌株的菌丝生长都有一定的抑制活性。对真菌的抑制率与提取液浓度存在一定的线性相关，其中红葱10%提取液对2种真菌菌株抑制率最高，达到100%。大红菇提取液对烟草青枯病菌表现出农用链霉素相当的抑菌效果；奶浆菌提取液对异丝腐霉的毒力最强，红葱和黑牛肝提取液次之，大红菇提取液对异丝腐霉的毒力最弱；黑牛肝提取液对黑胫病菌的毒力最强，块菌和红葱提取液次之，而1.7%美味牛肝菌提取液对黑胫病菌有促进菌丝生长作用；奶浆菌提取液对黑胫病菌的毒力最弱。可见11种供试食用菌中确实存在抗植物病原菌物质，为生物抑制剂的开发提供了依据。

食用菌；烟草；病原菌；抑制作用

农业的高速发展，“无公害”、“绿色”、“有机”农产品已成为公众关注的焦点[1]。2010年《有机烟叶》[2]云南地方标准发布，2011年9月，用有机烟叶卷制的卷烟“玉溪庄园”在中国隆重上市，标志着有机烟叶的研发与产品生产在国内全面启动[3]。随着栽培条件的变化, 烟草的病虫害危害也日益严重, 造成巨大的经济损失。据不完全统计，我国每年烟草病害造成的直接经济损失在7亿元以上[4]。烟草病害是制约烟草质量和品质的重要因素，其发生的病害种类多，症状复杂，降低了吸烟的安全性。早在19世纪70年代，人们就发现多种担子菌子实体、食用菌深层发酵液和固体培养物水浸液对植物病毒有抑制作用[5-7]。研究报道从铁椆与红菇[8]、松乳菇[9]、松茸发酵物[10]、灵芝[11]、茶树菇[12]、苍耳[13]、花脸香蘑[14]、竹荪菌[15]、鸡腿菇[16]和金针菇[16]等多种食用菌中分离到抗菌活性成分。因此，筛选有效抑制植物病毒病害的大型真菌以及分离出其中的抗菌活性成分,对防治植物病虫害具有重要的意义。

本文对11种食用菌蒸馏水提取液进行了抑制烟草异丝腐霉病菌(PythiumdiclinumTokunaga in Ito & Tokunaga)、黑胫病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)和青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)3种病原菌的测试，为生物农药的开发提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试食用菌菌种共11种，包括红葱E.americanaMerr.ex Heyne、香菇Lentinusedodes、木耳Auriculariaauricula、块菌Tubermelanosporum、黑牛肝BoletusaereusFr.ex Bull.、黄牛肝Termitomyceseurrhizus(Berk.) Heim、美味牛肝菌BoletusedulisBull ex Franch、大红菇RussulaalutaceaFr.、奶浆菌Lactariusvolemus、青头菌Russulavirescens(Schaeff.ex Zanted)Fr.和虎掌菌Sarcodonimbricatus等11种食用菌干样，购自于云南昆明木水花野生菌批发市场。

供试病原菌菌种共3种，包括烟草异丝腐霉病菌PythiumdiclinumTokunaga in Ito & Tokunaga、黑胫病菌Phytophthoraparasiticavar.nicotianae(Bredadehean) Tucker和青枯病菌Ralstoniasolanacearum(E.F.Smith) Yabuuchietal，由本实验室培养保存。

主要仪器及试剂：TTC、2,3,5-氯化三苯基四氮唑，由本实验室保存；超净工作台、烘箱、烧杯、移液枪、医用真空抽滤泵、搅拌机、粉碎机、高压灭菌锅等实验器材。

1.2 实验方法

1.2.1 活性成分的提取

11种食用菌子实体去杂、洗净，65℃烘干，粉碎备用。各取5 g子实体粉称重后置于烧杯中，加入20倍重量蒸馏水，由于木耳提取液比较黏稠，按1∶50的比例加入250 mL蒸馏水，搅拌机搅拌加速溶解，用0.45 μm微孔滤膜过滤和真空抽滤泵进行抽滤，得到无菌提取液，置于4℃冰箱中备用。

1.2.2 培养基的制备

燕麦培养基的制备：称取燕麦50 g，加1 L水放入搅拌机充分搅拌，再用4层纱布进行过滤，电磁炉上加热燕麦液体，边搅拌边缓慢加入琼脂粉20 g，使琼脂粉完全溶解，再补足水至1 L，经121℃高温灭菌后冷却至50℃左右。

TTC琼脂培养基的制备：称取蛋白质10 g、水解酪蛋白1 g、葡萄糖10 g，加热使其充分溶解于1 L水中，并边搅拌边缓慢加入琼脂粉17 g，调节其pH，使pH在7.2左右。经121℃高温灭菌后冷却至50℃左右，加入0.5%的TTC溶液1 mL摇匀。

1.2.3 病原真菌菌丝生长抑制实验

病原菌菌丝生长的抑制作用采用生长速率法。在无菌条件下，用移液枪分别移取制备好的不同无菌食用菌提取液6 mL、3 mL、1 mL，分别加入到54 mL、57 mL、59 mL且冷却至45℃左右的燕麦培养基中摇匀，使其最终体积为60 mL，倒入3个培养皿，每皿20 mL，分别得到含10%提取液成分、5%提取液成分、1.7%提取液成分的培养基。凝固后分别用孔径为0.8 cm的打孔器，取菌落边缘生长旺盛的菌种接种到含有提取物的燕麦培养基平板上，每个培养皿接种1个菌饼，每个处理3次重复。以无菌水加入到培养基作为对照,然后置于28℃的恒温培养箱内培养。培养24 h后，每隔12 h进行1次拍照、测量直径，按照十字交叉法测量2次，以其平均值代表菌落直径的大小。纯生长量(D)、抑制率(P)的计算公式分别为：

D=d1-d2

P= (D1-D2)D1×100%

式中：d1表示菌落平均直径(cm)；d2表示菌饼直径(cm)；D1表示对照纯生长量(cm)；D2表示处理纯生长量(cm)。

1.2.4 青枯病菌生长抑制实验

采用滤纸圆片法测定食用菌提取液对青枯病菌菌丝生长的影响。使用打孔器在滤纸片上打39个直径为0.8 cm的小圆片，装在试管中进行密封灭菌。超净工作台上，将灭好的滤纸片每3个为1组，放入各种食用菌提取液中浸泡4 h～5 h，以蒸馏水为空白对照，配制的等体积农用链霉素为农药对照，共计13个处理。操作方法是将配制好的一定浓度的菌悬液0.1 mL，与灭好菌的冷却至50℃的TTC琼脂培养基在培养皿内充分摇匀，待培养基凝固后，把经过不同处理浸泡的滤纸片等距离放于培养基上，每皿3片，封口置于32℃的恒温培养箱中培养48 h后，观察测量抑菌圈直径。抑制率(P)的计算公式为：

P=(d3-0.8)- (d4-0.8)(d3-0.8)×100%

式中：d3表示对照直径(cm)；d4表示处理直径(cm)。

1.3 数据统计分析

实验数据采用Microsoft Excel 2010处理，采用DPSv6.55版本进行毒力回归分析和方差分析。

2 结果与分析

2.1 11种食用菌提取液对2种烟草真菌菌丝生长的抑制作用

不同浓度食用菌提取液对烟草异丝腐霉、黑胫病菌丝生长的抑制率见表1、表2。从实验测定结果(表1和表2)可以看出，11种食用菌提取液在实验浓度下，对2种烟草真菌菌丝生长有不同程度的抑制作用。抑制率随浓度的降低而降低，不同食用菌提取液之间对同一种病原真菌的抑制率也有差异。其中，红葱10%提取液对2种烟草病原真菌的抑制率均达100%。而奶浆菌提取液对异丝腐霉的抑制率最低，黄牛肝提取液对黑胫病菌的抑制率最低。美味牛肝菌提取液在1.7%浓度有促进黑胫病菌菌丝生长的作用。

2.2 11种食用菌提取液对烟草真菌病原菌的毒力

11种食用菌提取液对烟草异丝腐霉病菌的毒力回归分析结果见表3。

从表3可以看出，奶浆菌提取液对异丝腐霉的毒力作用最强，EC50为0.06%，大红菇提取液对异丝腐霉的毒力最弱，EC50为2 287.56%。11种食用菌提取液对异丝腐霉的毒力大小依次为奶浆菌提取液>红葱提取液>黑牛肝提取液>块菌提取液>木耳提取液>美味牛肝菌提取液>虎掌菌提取液>黄牛肝提取液>香菇提取液>青头菌提取液>大红菇提取液。11种食用菌提取液对烟草黑胫病菌的毒力回归分析结果见表4。

表1 不同浓度食用菌提取液对烟草异丝腐霉菌丝生长的抑制率

注：表中同行数据后不同小写字母表示差异显著(p=0.05)。

表2 不同浓度食用菌提取液对烟草黑胫病菌丝生长的抑制率

注：表中同行数据后不同小写字母表示差异显著(p=0.05)。

表3 11种食用菌提取液对烟草异丝腐霉病菌的毒力回归分析

表4 11种食用菌提取液对烟草黑胫病菌的毒力回归分析

续表

食用菌回归方程相关系数EC50∕%95%置信区间黄牛肝Y=3.0280+1.0018X0.9293.016.98～1239.66奶浆菌Y=3.9457-0.0676X-0.190.000.00～2698E+149大红菇Y=4.0774-0.0926X0.809131176660.000.00～6.47E+23虎掌菌Y=3.4021+0.7643X0.88123.193.13～4844.37青头菌Y=3.4179+1.3887X0.9613.786.38～29.75

从表4可以看出，黑牛肝提取液对黑胫病菌的毒力最强，EC50为1.18%，奶浆菌提取液对黑胫病菌的毒力最弱，EC50为0.00%。11种食用菌提取液对异丝腐霉的毒力大小依次为黄牛肝提取液>黑牛肝提取液>红葱提取液>块菌提取液>木耳提取液>美味牛肝菌提取液>青头菌提取液>香菇提取液>虎掌菌提取液>大红菇提取液>奶浆菌提取液。

从表3和表4可以看出，同一种食用菌提取液对不同烟草真菌的毒力作用相差较大。

2.3 11种食用菌提取液对青枯病病菌菌丝生长的影响

不同食用菌提取液对烟草青枯病菌的抑菌作用见表5。

表5 不同食用菌提取液对烟草青枯病菌的抑菌作用

从表5可以看出，不同食用菌提取液对烟草青枯病菌均有一定的抑制作用。经分析各种食用菌提取液的抑菌效果与对照比较均有显著差异，大红菇提取液对烟草青枯病菌表现出与农用链霉素相当的抑菌效果，抑制率为175.00%，木耳提取液对烟草青枯病菌的抑菌效果较差，抑制率为65.00%。

3 讨论

食用菌中多糖、脂类、蛋白质等活性物质含量丰富，王先彬[ 7]对香菇培养物水浸液进行了详细研究，证明了其对烟草花叶病毒有钝化作用,因此证明食用菌中确实存在各种真菌及病毒的抑制物。本实验初步研究了11种食用菌提取液对3种烟草病原菌的抑制作用。红葱为莺尾科红葱属植物，根据文献报道目前已从红葱属中分离出蔡酚类、蔡酿类和葡萄糖昔类等十几个化合物，其中的一些成分具有增加冠状动脉血流量、抑制人体拓扑异构酶等多种药理活性[17]，潘俊等[18]首次报道了红葱对百合炭疽病的抑菌活性，而红葱、黑牛肝和块菌等对烟草病原菌的抑菌活性此前未见报道。本文中活性筛选只是初期的研究指导，需要跟踪分离找到其它活性化合物后进一步验证，并对其构效关系和机理进行深入研究。

由本实验可知，红葱和黑牛肝提取液对真菌的抑制率高，毒力相对也高，毒力与抑制率之间存在着正相关。但是，奶浆菌提取液对异丝腐霉的抑制率较弱，毒力却是最强的，它们之间存在着负相关。对于某一种特定的药剂来说，毒力与抑制率之间究竟存在怎样的相关性，需要进一步探索和研究。

[1] 徐建平，刘有才. 烟草在线[EBOL]. (2009-04-01)[2009-05-27]. http:www.tobaccochina.comtobacco leaffarmingtechnique20095200952685716_360887.shtml.

[2]云南省质量技术监督局，云南省标准化管理委员会. DB53T311.1-3-2010，有机烟叶[S].

[3]郭怡卿，戴勋，张光煦，等. 有机烟草生产与烟叶质量安全性[J]. 云南农业科技，2012(4).

[4]赵荣艳，杨靖华，蒋士君. 烟草病害生物防治研究进展[J]. 安徽农业科学，2006，34(22)：5918-5919，5968.

[5]王晶英，郑雅莺，张建光，等. 食用菌代谢产物研究及其在农业上的应用[J]. 中国食用菌，1997，16(2)：6-7.

[6]高木康至，岛田和纯. 伞菌类锯木屑培养物提取液对TMV的防治效果[J]. 日植病报，1977(43)：211-214.

[7]王先彬，王启燕. 香菇培养物水浸液对烟草花叶病毒(TMV)侵染心叶烟的抑制作用[J]. 微生物学报，1986，26(4)：363-365.

[8]刘英姿，甘耀坤，陈旭健，等. 铁椆与红菇提取液抑菌作用的比较[J]. 食品科学，2011，32(5)：36-38.

[9]任慧波，杜丽飞，肖兵南，等. 松乳菇菌丝体胞内多糖与胞外多糖体外抑菌试验[J]. 饲料工业，2009，30(20)：31-32.

[10]胡尚勤，刘天贵. 松茸发酵物中活性成分的提取与作用的研究[J]. 安徽农业大学学报，2006，33(4)：499-501.

[11]赵成萍，冯翠萍，常晓敏. 灵芝多糖抑菌作用的研究[J]. 中国食用菌，2012(2)：60-61，64.

[12]辛英姬，方绍海，王筱凡，等. 茶树菇多糖抑菌效果的试验[J]. 中国食用菌，2011(4)：64-65.

[13]许玉娟，范素素，齐文静，等. 苍耳多糖对烟草花叶病毒的抑制作用及对烟草几种防御酶活性的影响[J]. 山东农业大学学报：自然科学版，2010，41(4)：485-488.

[14]刘艳如，李小明，李军进，等. 花脸香蘑对水稻细条病的抑制活性研究初报[J]. 中国农学通报，2012，28(12)：202-205.

[15]杨威. 棘托竹荪菌丝体提取液对松茸、羊肚菌保鲜的研究[D].昆明：昆明理工大学，2010.

[16]马学萍，段云晖，孔宝华，等. 食用菌提取物对烟草花叶病毒的抑制作用[J]. 云南农业大学学报，2007, 22(2)：296-298.

[17]徐金钟，邱峰，曲戈霞，等. 红葱稻瘟霉活性成分研究[J]. 中国药物化学杂志，2005，15(3)：157-161.

[18]潘俊，张焱珍，李晚谊，等. 红葱抑制植物病原菌活性成分研究[J]. 西南农业学报，2011，24(6)：2246-2248.

Inhibition Effect of Extracts on Pathogenic Fungi in Tobacco from Edible Mushroom Varies

GAO Xian-liang1, LUO Hua-yuan2, MEI You-kun1, Dong Shi-fei2, LUO Yi1, RAO Zhi2, ZHONG Yong-li1, LAN Jian-qiang1,3

(1.College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, KunmingYunnan650201; 2.Hongyun-Honghe Group Co., LTD, KunmingYunnan650231; 3.College of Tobacco, Yunnan Agricultural University, KunmingYunnan650201)

The inhibition effect of the extracts from eleven species of mushroom, such asE.americanaMerr.ex Heyne,Lentinusedodes,Auriculariaauricula,Tubermelanosporum,BoletusaereusFr.ex Bull.,Termitomyceseurrhizus(Berk.) Heim,BoletusedulisBull ex Franch,RussulaalutaceaFr.,Lactariusvolemus,Russulavirescens(Schaeff.ex Zanted)Fr. andSarcodonimbricatus, on the growth ofPythiumdiclinumTokunaga in Ito & Tokunaga,Phytophthoraparasiticavar.nicotianaeandRalstoniasolanacearumwas experimented. The powder of the eleven species of edible mushroom were mixed with distilled water and stirred broken, filtered by 0.45 m micro porous membrane and vacuum pump filter to obtain sterile extract. The inhibition effect of the extracts on three species of fungi was tested. The results showed that the extracts from the eleven edible mushrooms could inhibit the hyphae growth of the three kinds of pathogenic fungi, and the fungal inhibition effect was the linear correlation with the concentration of extracts. The inhibition effect of the extracts fromE.americanaMerr.ex Heyne on 2 fungal strains was the highest, reaching to 100%. The extracts fromRussulaalutaceaFr. had better inhibition effect onRalstoniasolanacearumthan others, and 1.7%BoletusedulisBull ex Franch extract could even promote the hyphae growth ofPhytophthoraparasiticavar.nicotianae. TheLactariusvolemusextract had highest toxicity onPythiumdiclinumTokunaga in Ito & Tokunaga, followed byE.americanaMerr.ex Heyne extract andBoletusaereusFr.ex Bull. TheRussulaalutaceaFr. extract had lowest toxicity. TheBoletusaereusFr. ex Bull extract had highest toxicity onPythiumdiclinumTokunaga in Ito & Tokunaga, followed byE.americanaMerr.ex Heyne extract andTubermelanosporum. TheLactariusvolemusextract had lowest toxicity. There were the anti-pathogenic materials in eleven species of mushroom, which could lay the foundation for the development of bio-inhibitor.

Edible mushroom; Tobacco; Pathogenic fungi; Inhibition effect.

*项目来源：云南中烟资助项目“优质烟叶生产技术体系建设”(2011JC-2)。

高现亮(1987-)，男，在读硕士研究生，主要从事生物农药开发研究。E-mail: 644187390@qq.com

**通信作者： 兰建强，男，副教授，主要从事烟草病害防治和生物农药开发研究。E-mail: jqlan92@163.com

2014-03-26

S646.9

A

1003-8310(2014)03-0034-04