唐 丽，夏雨婷，贾杏林，朱珍珍

（湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128）

球状附红细胞体首次在啮齿类动物血液中被发现[1,2]，我国在上世纪80年代江苏、宁夏、河北、广州等地开始报道猪附红细胞体，许耀成等最早在江苏发现猪附红细胞体病[3]。临床上猪附红细胞体病猪主要表现为贫血、黄疸，体温高达39.5～41.5℃，长期稽留，两耳肿胀或发绀；便秘，粪便被有黏膜或粘液，严重时带血，后期尿液呈棕红色[4]。该病给养猪业带来较大的经济损失。目前该病原的研究在分子生物学取得了一些进展[5,6]。但是由于培养体系的不够完善，限制了该病的研究，目前有关该病的致病机理还不是很清楚[7]。免疫血清在疾病的紧急预防与治疗方面的作用非常突出，免疫制备阳性血清在疾病诊断和病原鉴定方面有很大的作用[8]。为了获得效价较高的免疫血清,动物需要保持临床健康状态，需要合理的免疫剂量、次数、时间间隔,本研究进行了兔抗猪附红细胞体阳性血清的制备。

1 材料和方法

1.1 试验仪器和试剂

仪器设备：微量分光光度计（ThermoNANO DROP2000）、酶标仪、无菌操作台、高速离心机、高压灭菌锅。

试剂：弗氏佐剂、TMB购自Sigma公司；酶标二抗（1：1000）购自索莱宝公司。

1.2 试验动物

新西兰大白兔3只，A兔2.87kg，B兔1.80kg，C兔1.86kg，均购自专业化养兔场。猪附红细胞体抗原由湖南农业大学动物医学院李晓云博士等人提供。

2 试验内容

2.1 抗原乳化

在无菌条件下取出的抗原溶液，12000r/min离心约10min，弃上清液，加一定的无菌生理盐水离心洗涤2次后，加入一定量的无菌生理盐水悬浮抗原，用微量分光光度计A260/A280测定蛋白浓度，将抗原溶液稀释到8.333mg/mL，加等量的弗氏佐剂乳化，使抗原溶液乳化均匀。

2.2 免疫

3只试验兔饲养7d，体温呼吸脉搏均正常，试验前采血1.5mL,分离血清进行IHA检测，结果为阴性。按照兔的体重分别注射一定量乳化后的抗原，平均分点对家兔进行肌肉注射免疫。14d后加强免疫1次，A兔注射乳化抗原2.0mL，B兔注射乳化抗原2.0mL，C兔注射2.0mL的生理盐水。1个月后再加强免疫1次，A兔注射乳化后抗原2.0 mL，B兔注射乳化后抗原2.0mL，均分4点注射，C兔子注射2.0mL的生理盐水。1个月后，再同前一次加免1次。15d后心脏采血，从A兔采集血液50.0mL，B兔采血30.0mL，C兔子采血30.0mL，分离血清4℃保存。

2.3 间接ELISA 检测抗体

通过方阵试验，以最佳抗原浓度800μg/mL包被抗原，4℃过夜，用1%BSA封闭，加入1:40稀释后的血清，作用一定时间后加入1:1000稀释的酶标二抗，37℃作用45min，洗涤5次后，加TMB，37℃显色15min，用酶标仪测定波长450nm的吸光值。

3 试验结果

3.1 免疫后A、B 两只兔子体温变化结果

如图1所示，第1次免疫后A、B体温略升高，但在正常范围内波动，C兔子的体温无变化，第2、3、4次免疫后体温无变化。

3.2 脉搏和呼吸

进行免疫后呼吸和脉搏均处于正常范围内。

3.3 抗体水平检测

注射生理盐水的对照C兔的血清用IHA为阴性，注射乳化抗原的2只兔子在第4次免疫3d后，ELISA检测OD值逐渐升高，至第7d达到最高值，之后维持相对稳定，在第15d心脏采血分离免疫血清，此血清即为本试验室制备的阳性血清。制备的兔抗猪附红细胞体免疫血清按1:80稀释后，A、B兔子血清经ELISA检测OD值为0.922、0.823，而阴性血清OD值为0.115，P/N分别为8.02（P/N＞2.1）、7.16（P/N＞2.1）。

4 讨论

由图1的体温变化情况来看,免疫后的兔子体温有一个定程度的升高，这个可能是与机体的免疫反应有关系,但均在正常范围内，表明免疫产生的发热反应不强。通过本次试验，探索出了兔抗猪IgG免疫血清最佳的免疫时间间隔、免疫剂量和免疫次数。利用ELISA对猪附红细胞体免疫兔后的血清进行检测发现，兔对猪附红细胞体具有免疫力，能够制备出兔抗猪附红细胞体免疫血清，这为猪附红细胞体抗原的鉴定、猪附红细胞体病的诊断提供了材料，同时，免疫血清的制备为该病的阻抑和该病的治疗有一定的应用价值。

[1]Mayer M.übereinige bakterienahnliche Parasitender Erythrozyten bei Menschen und Tieren[J].Arch Schiffs Trop Hyg,1921, 68:115-116.

[2]Schilling V.Eperythrozoon coccoides,eine neue durch Splenektomie aktivierbare Dauerinfektion der weissen Maus[J].Kiln Wochenschr.1928:1854-1855.

[3]许耀成,张万帮.红皮猪血液内发现大量附红细胞体初报[J].兽医科技杂志，1982,(2):32-32.

[4]Chen Y Y，He H X，Wang T Y.Aetiogical investigation of the swine eperthrozoonsis[J].Journal of Henan Vocation-Technical Teachers Collega,2001,(2):33-34.

[5]Masatoshi,Hisato,Kazuya.Two Genetic Clusters in Swine Hemoplasmas Revealed by Analyses of the 16S rRNA and RNase P RNA Genes[J].Vet.Med.Sci. 2011.73(12):1657-1661.

[6]唐 丽,李晓云,贾杏林.猪附红细胞体分子生物学研究进展[J].中国畜牧兽, 2013,40(7):81-83.

[7]贾杏林，张武林，李晓云.猪附红细胞体致病机理的研究进展[J].中国畜牧兽.2010,37(5):149-151.

[8]王占伟，邵国青，陈笑娟. 动物抗血清及其制备技术要点与应用进展[J］.江西农业学报,2009,21(7):149-152.