崔丽娟，徐刚，孟枭，吴坚平，杨立荣

（浙江大学化学工程与生物工程学系，浙江 杭州 310027）

多元电解质对脂肪酶有机相拆分炔戊醇的激活

崔丽娟，徐刚，孟枭，吴坚平，杨立荣

（浙江大学化学工程与生物工程学系，浙江 杭州 310027）

脂肪酶是一种应用节广泛的重要生物催化剂，提高脂肪酶在非天然环境中的催化性能逐步成为了一个研究热点。研究表明，某些电解质的加入可显著提高提脂肪酶在有机溶剂体系中的酶活和选择性。然而有关研究主要考察单一电解质的作用，且涉及的电解质种类较少，更为系统的研究未见报道。本文以洋葱假单胞菌脂肪酶（Pseudomonas cepacialipase，即PcL）催化手性菊酯农药前体4-甲基庚-4-烯基-1-炔基-3-醇（炔戊醇）在甲苯中选择性转酯化为模型，系统考察了卤化物、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐等8类35种电解质单独以及多种电解质协同对PcL催化性能的影响。结果表明，NaF-Na2HPO4/NaH2PO4的二元电解质体系具有远高于任意单一电解质组分的性能，该体系使PcL活力提高23倍。进一步研究表明，这一电解质体系对PcL催化不同对映体转酯化的活力提高程度不同，从而将其对映体选择率（E值）由11提高到21。

有机相；电解质；脂肪酶；对映体选择性；催化活力

有机相酶催化研究是一个值得关注的焦点。为了改善酶在有机相中的催化特性，研究者从不同角度出发，设计了一系列高效的研究方法[1-3]。这些方法可简单分为两类：催化剂工程和溶剂工程。前者主要通过蛋白质工程或调控酶的微环境[4-8]来改善酶的催化性能；后者主要通过添加少量水[9]或改变溶剂的疏水性[10]和极性[11]来改善酶的催化性能。其中，通过加入电解质来调控酶的微环境是最简便有效的。研究表明，经电解质处理后，酶的催化性能得到显著改善[12-15]，这引起了学术界对其研究的广泛兴趣。1994年Clark等[16]首次报道了在酶的冷冻干燥（大多数应用到有机相体系中的酶粉由喷雾干燥制得，而经电解质处理的酶粉需要特殊方法制备，如冷冻干燥等）体系中加入非缓冲盐可以大幅度提高其催化效率。他们通过向Hay bacillus protease的冻干体系中加入KCl，使其在正己烷中酯交换反应的kcat/Km值比无盐加入时提高了3750倍。Yang等[17]发现通过加入EDTA-2Na，Candidasp. Lipase在正己烷中的转酯化活力较原始酶提高了27倍。Yu等[18]发现加入LiCl后，Candida rugosaLipase在异辛烷中的酯化活力较原始酶提高了2倍，选择性提高了1.6倍。Salis等[19]发现向Pseudomonas cepaciaLipase（PcL）的冻干体系中加入Na2SO4后，其在2-甲基-2-丁醇中的酯化活力较原始酶提高了9倍。Li等[20]研究发现，通过精确调控冻干过程，磷酸缓冲盐掺杂能够将PcL在有机相中的转酯化活性提高近10倍，达到其水相本征活性的50 %。但目前在非天然体系中，关于电解质对脂肪酶催化性能影响的系统性研究以及不同电解质的协同作用却鲜有报道。

本文以PcL在甲苯中催化4-甲基庚-4-烯基-1-炔基-3-醇（炔戊醇，MEYO）与乙酸乙烯酯转酯化反应为研究对象，其中，炔戊醇是一种重要的手性农药中间体，其S构型是一类拟除虫菊酯产品的活性组分[21]。通过对35种电解质及其不同组合的研究，系统性地考察了电解质的种类、组合方式以及电解质的浓度对有机相中脂肪酶酶促转酯催化性能的影响，最终发现经NaF-Na2HPO4/NaH2PO4的二元电解质体系（NaF 0.24mmol/L，Na2HPO4/ NaH2PO4100mmol/L）处理后，PcL的催化活力提高了23倍，对映体选择率提高到初始的2倍。

1 实验部分

1.1 实验材料

洋葱假单胞菌脂肪酶（Pseudomonas cepaciaLipase，缩写为PcL，商品名Lipase PS）购自Amano Enzyme Inc.。炔戊醇、甲苯、乙酸乙烯酯、NaF、NaSCN、NaNO3、Na2CO3、Na2SO4、NaH2PO4、CH3COONa、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、NaOH、HCl等，购于Sigma-Aldrich Inc.。

1.2 经电解质处理的PcL样品制备

按需配制一定浓度的电解质溶液，用pH计（PHS-3C，上海精密科学仪器有限公司）进行校准，调整溶液的pH值到7.0。然后在4℃下，将0.030gPcL溶于3mL上述电解质溶液中，振荡，分装，-196℃预冻20min，冷冻干燥12h，冷冻干燥方法参照文献[22]，冻干完成后将样品取出，储于4℃保存待用。

1.3 模型反应

PcL催化转酯化拆分炔戊醇的反应式如图式1所示。反应在2mL Axygen密闭反应管中进行。反应条件为：甲苯1mL，炔戊醇100mmol/L，乙酸乙烯酯300mmol/L，粗酶粉（处理或未处理）10mg/mL，35℃，转速220r/min。

1.4 数据分析

采用气相色谱仪（Fuli 9790型，温岭福立分析仪器有限公司）分析样品中各组分含量，CP-cyclodextrin-B-2,3,6-M-19手性柱。色谱条件为：气化温度250℃，检测温度260℃，柱温110℃，载气氮气流速为45mL/min。(S)-酯、(R)-酯、(R)-醇和(S)-醇对应的保留时间均由标品确定，分别为20.8min、21.8min、22.5min 和24.7min。

根据反应初始阶段（转化率小于5%）单位时间内产物的增加量计算PcL的酶活。

图1 PcL催化转酯化拆分rac-炔戊醇

式中，X 为底物转化率，X = (c0- c)/c0，c0及 c分别为反应前后底物醇的浓度，mmol/L；t为反应进行的时间，min；m为反应中使用的酶量，mg；p为PcL的蛋白含量，%。

参照文献[23]计算反应的对映体选择率：E = ln[1-X(1+eep)]/ln[1-X(1-eep)]，其中eep为产物对映体过剩值，eep=|(S)-酯%-(R)-酯%|/[(S)-酯%+(R)-酯% ]。

2 结果与讨论

2.1 电解质种类对PcL催化转酯性能的影响

系统考察了8类35种电解质及其组合方式对PcL催化炔戊醇转酯性能的影响，阳离子的影响见表1。可知，除Ni2+、Fe3+、Cu2+、Hg2+和Zn2+等过渡金属离子外，大部分阳离子对PcL催化活力的影响较微弱，过渡金属离子易与蛋白质发生特异性结合，形成沉淀，从而造成酶分子的不可逆失活。作者认为，电解质一方面可以调节酶微环境中的水活度，另一方面可以通过与酶分子间形成氢键和盐桥来调节酶制剂的极性。而在不同溶剂中，同一种脂肪酶对水活度与极性的需求不同。这也是与文献[17] 相比，该反应体系中 Na2SO4（表 1，编号1）未对PcL产生激活作用的原因。

阴离子的影响见表2。可知，大部分阴离子对PcL催化转酯活力未见激活作用，而F-与其他卤离子显示出不同的规律，添加NaF（表2，编号20）后，PcL的催化活力较原始酶提高了1.6倍，因F-原子半径较小，负电荷集中，易与酶分子周围的阳离子产生静电相互作用，利于维持酶分子的原始构象；加入Na2HPO4/NaH2PO4（表2，编号30）后，PcL的催化活力较原始酶提高了1.7倍，其激活程度小于文献[18] 中的数值，除溶剂因素外，磷酸缓冲盐pH值的不同也是影响酶催化性能的关键因素。

表 1 电解质阳离子对 PcL 催化转酯性能的影响

表2 电解质阴离子对PcL催化转酯性能的影响

除阴阳离子外，进一步研究了多种阴阳离子协同作用对PcL催化转酯性能的影响，表3可知，不同电解质组合后，PcL被迅速激活，经NaF与Na2HPO4/NaH2PO4（表3，编号5）混合作用，PcL的催化活力较原始酶提高了17倍，可见，多种电解质混合后具备了不同于单一电解质独立存在时的性质。此结论独立于电解质对脂肪酶的激活机理遵循霍夫迈斯特次序（按电解质聚沉能力的大小，排列所得）[24]，以及与电解质JDB因子（JDB因子用来衡量电解质增加或降低水黏度的程度）[25]相关的假说。

2.2 电解质浓度对PcL催化转酯性能的影响

由图2可见，当NaF或Na2HPO4/NaH2PO4单独存在时，电解质浓度对PcL催化活力的影响不甚显著； NaF-Na2HPO4/NaH2PO4协同作用后，36组不同浓度组合呈现出规律性分布。在一定范围内，电解质总浓度的提高较电解质浓度单一性提高，PcL催化活力的提升更加显著，当到达一定含量后，PcL的催化活力随着电解质含量的增加而不断下降。推测，电解质含量的增加有利于其与酶分子间相互作用力的形成，经饱和状态之后，继续增加电解质的含量，此时多余的电解质就会覆盖在酶分子的表面，阻碍脂肪酶与底物的接触，从而使PcL的催化活力下降。可见，适宜的电解质含量有利于保持酶的催化活力，当NaF与Na2HPO4/NaH2PO4的浓度分别为0.24mmol/L、100mmol/L时，PcL的催化活力[3.342U/(mg蛋白质)]达到最佳，约为原始PcL催化活力[0.148U/(mg蛋白质)]的23倍。

表 3 电解质的不同组合对PcL催化转酯性能的影响

2.3 电解质对PcL 催化不同对映体转酯活力的影响

图2 NaF与Na2HPO4/NaH2PO4的浓度对PcL催化转酯活力的影响

图3 NaF-Na2HPO4/NaH2PO4二元电解质体系对PcL催化不同对映体转酯化活力的影响

研究了PcL催化的单一构型（R或S）炔戊醇体系，图3为 NaF-Na2HPO4/NaH2PO4二元电解质体系对PcL催化不同对映体转酯化活力的影响。由图3可见，对同一种构型而言，NaF-Na2HPO4/ NaH2PO4二元电解质体系比任意单一电解质（NaF或 Na2HPO4/NaH2PO4）对PcL催化活力的影响更加显著，这亦进一步证实2.1节的研究结果；两种构型相比较，以原始酶的催化活力为基准，分别向冻干体系中加入NaF、 Na2HPO4/NaH2PO4、NaFNa2HPO4/NaH2PO4后，υR的提高较υS更加明显，从而使其对映体选择率（E值）由 11提高到21。

3 结 论

通过对8类35种电解质及其组合的研究，表明多种电解质的协同作用比单一电解质对PcL催化性能的影响更加显著。另外，经电解质处理后，酶催化不同对映体转酯化活力提高的程度不同，从而使其对映体选择率（E值）得到相应的提高。

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Multi-electrolytes activation of Lipase for 4-methylhept-4-en-1-yn-3-ol resolution in organic media

CUI Lijuan，XU Gang，MENG Xiao，WU Jianping，YANG Lirong
（Department of Chemical and Biological Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，Zhejiang，China）

Lipase was an important biological catalyst，which was widely applied in many areas，how to improve its catalytic performance in non-natural environment has become a research hot spot gradually. Studies showed that the specific activity and enantioselectivity of lipase could be improved remarkably by adding some electrolytes into reaction system. However，relevant researches mainly focused on the role of single electrolyte，report on the types of electrolytes involved was much less，and further systematic research has not been reported yet. By utilizingPseudomonas cepacialipase （PcL）as the catalyst，the asymmetric transesterification resolution of 4-methylhept-4-en-1-yn-3-ol was conducted with the precursor of chiral chrysanthemum ester pesticides in hydrophobic organic media，the influences of 8 types，including halide，nitrate，sulfate，phosphate et al，35 kinds of electrolytes and their different combinations on PcL's catalytic performance were investigated systematically. The results indicate that the specific activity of PcL is 23 times higher than that of native lipase with synergistic effect of NaF，Na2HPO4and NaH2PO4. Further study shows that the improvement of enantioselectivity has been achieved from 11 to 21，due to the different degree of activation of enantiomers by PcL.

organic media；electrolytes；lipase；enantioselectivity；catalytic activity

O 643

A

1000-6613（2014）08-2150-05

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.08.035

2013-12-18；修改稿日期：2014-01-07。

国家 973 计划（2011CB710800）、国家自然科学基金（20936002）及国家 863 计划（2011AA02A209）项目。

崔丽娟（1989—），女，硕士研究生。联系人：吴坚平，副教授，研究方向为生物催化与转化。E-mail wjp@zju.edu.cn。