王立，张晓薇

(1.广东省江门市新会区林业科学研究所，广东江门 529100; 2.华中农业大学，武汉 430070)

矮牵牛转SAG12－IPT基因的研究

王立1，张晓薇2

(1.广东省江门市新会区林业科学研究所，广东江门 529100; 2.华中农业大学，武汉 430070)

通过转基因的方法，以矮牵牛(Petunia hybrida Vilm)为例，将延长植物衰老的有效基因SAG12－IPT转入矮牵牛中，经抗生素筛选，得到了再生的转化植株，以克服其花期短尤其切花时间短的缺点，为转基因花卉的研究和推广提供理论支持，利于切花花卉在家居装饰中的运用推广。

矮牵牛;叶片衰老;SAG12;组织培养

矮牵牛(Petunia hybrida Vilm.)原产南美，茄科矮牵牛属。花大色艳，花色丰富，为长势旺盛的装饰性花卉，而且还能做到周年繁殖上市，可广泛用于花坛布置、花槽配置、景点摆设、窗台点缀、家庭装饰。该花抗旱性好、花期较长，受到人们的青睐，需求量与日俱增。

花卉花期的长短与许多因素相关，如温度、营养等外界环境因素。通过改变环境和营养调控等方法可达到延长花期的目的，但这些外在的手段费时费力。如果能通过基因工程手段改变其遗传基础，则可选育具有遗传稳定性的花期延长的新材料。本实验将含有SAG12－IPT基因载体的质粒(美国威斯康星大学Amasino教授提供)转入农杆菌EH105和ABI菌株中，通过农杆菌叶盘法转化矮牵牛幼叶或茎尖，获得转化植株。本研究以矮牵牛的幼叶或叶柄为转化起始材料，采用常规的农杆菌介导法转化。对转化植株采用PCR、Southern、RT－PCR及Northern等方法进行分子鉴定。研究中所涉及的技术为植物组织培养和分子生物学的常用技术。

1 ⅡSAG12-IPT基因

1.1 1SAG12启动子在转IPT植株中的应用

1994年Lohman等［1］从拟南芥中分离得到一组衰老相关基因(SAGs)。研究表明:SAG12具有高度的衰老特异表达特性，可驱动IPT基因在植物衰老叶片中表达，有效调控内源细胞分裂素含量，在不影响植株正常发育的前提下，达到延缓叶片衰老的目的。

1995年Gan等［2］把SAG12特异启动子与IPT构建形成PSAG12－ipt嵌合基因，通过根癌农杆菌介导转化烟草获得转基因植株。经研究发现，这种新型转基因植株与野生型相比，叶片衰老明显延迟，花数和生物量也有所增加，但形态方面无明显差别，根系发育完全，顶端优势得到保持，在生理方面也表现出光合作用的延长。同时，还对PSAG12－ipt和PSAG12－gus转化株的GUS活性进行了比较。结果表明:前者的GUS活性的提高明显比后者缓慢，说明PSAG12－ipt自调控系统确实起到了自动调节的作用。PSAG12－ipt自调控系统具有低水平表达、自动调节表达的优点，不需耗费较大的人力物力就可能延缓作物衰老，提高产量。这些都为转基因植株农业推广奠定了基础。

1.2 PSAG12-ipt转化植株和衰老调控

编码细胞分裂素生物合成限速步骤合成酶—异戊烯基转移酶(isopentenyl－transferases)的基因首先在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中得到鉴定，被称为IPT基因。随着拟南芥基因组测序工作的完成，对IPT基因又有了新的了解。研究表明:拟南芥的异戊烯基转移酶是被一个小的多基因家族编码，其结构与细胞腺苷酸异戊烯基转移酶和tRNA异戊烯基转移酶相似［3］。进行基因产物的生化分析还揭示了ADP和ATP是反应的优先底物。在对植物叶片衰老研究过程中，根据差异筛选和减扣杂交等检测手段，发现衰老叶片的RNA总量下降，特别是rRNA水平剧烈下降。相反，某些基因则在衰老开始后表达量逐渐升高，这类基因被称为SAG基因［4］。

目前已从拟南芥中克隆出SAG12。该基因的一部分功能已被证实与衰老细胞内的大分子物质的降解转运有关，如编码核酸酶、蛋白酶、酯酶、谷氨酰胺合成酶等的基因［4］。用带有源于拟南芥的衰老相关基因SAG12启动子和新霉素磷酸转移酶(NPT II)选择基因的双元质粒作为载体。将克隆自土壤农杆菌Ti质粒的IPT基因导入双元质粒构建表达载体，利用构建的含IPT基因的表达载体通过农杆菌介导法、基因枪法等途径转化植株，按照规定的程序获得转基因株系。获得的转基因植株还要通过PCR、Southern杂交等对所转IPT基因的稳定性进行检测。通过对GUS活性和细胞分裂素含量的分析，证明抑制衰老的自我调节系统在转基因植株中得到表达［4］。当叶片开始衰老时，SAG12基因启动子(PSAG12)被激活，表达IPT基因合成细胞分裂素。通过细胞分裂素抑制核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、蛋白酶等的活性，延缓核酸、蛋白质、叶绿体等的降解。同时细胞分裂素可促使营养物质向应用部位移动。

1.3 PSAG12-ipt对植株的生理影响

PSAG12－ipt转基因植株除了延缓下部叶片衰老外，其他形态学和野生型对照基本相同，如株高、叶型、侧芽萌发等［5］。但转基因植株种子萌发和幼苗生长相对缓慢，这可能是由于植株在早期生长时所转基因被激活引起的。研究还发现，PSAG12－ipt转基因植株茎干变粗，茎干内部的水含量也相应增加。已知细胞分裂素可以增加内部还原性糖的含量。因此，这些还原性糖的积累可能会导致渗透压的增加，促使植物吸水和细胞膨胀，最终使得茎干变粗和茎干内水量增加。转PSAG12－ipt基因还可延缓由水涝胁迫引起的衰老。当水涝胁迫消除后，转基因株系糖、叶绿素、细胞分裂素和脱落酸的恢复都比野生型迅速，转基因植株根部细胞分裂素积累更快［6］。

2 实验材料

本次实验采用生长活力较好的矮牵牛植株。实验载体采用SAG12－IPT基因载体的质粒，农杆菌为EH105菌液。基本培养基采用MS固体培养基:MS粉的质量体积分数为4.4 g/L;蔗糖的质量体积分数为30 g/L;琼脂质量体积分数为7～8 g/L。

实验所用的PSAG12－ipt基因体系如图1所示。

图1 PSAG12－ipt基因体系

3 建立并优化矮牵牛的转化及再生体系实验方法

实验分为3组，将含有SAG12－IPT基因载体的质粒(由美国威斯康星大学Amasino教授提供)转入农杆菌EHA105和ABI菌株中，通过农杆菌介导法转化矮牵牛幼叶，获得转化植株。由于该农杆菌载体本身是抗利福平和庆大抗生素，摇菌时需要在培养基里加入利福平和庆大霉素。待转入植物体内时，需用带有头孢霉素的培养基进行脱菌，把植物表面附着的菌杀死。最终要再用带有庆大霉素的培养基筛选转化成功的外植体。

3.1 无菌受体材料的预处理

叶片或茎尖用洗衣粉进行预处理20 min，再用蒸馏水冲冼1次，用70%乙醇(添加0.1%的吐温20)洗30 s，0.1%次氯酸钠消毒10 min，无菌水冲洗多次。将无菌叶片剪成0.5 cm×0.5 cm的小块，接种在愈伤组织诱导进行预培养2～3 d，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。

3.2 农杆菌培养

①从平板上挑取单菌落，接种到20 mL附加相应抗生素的YEP培养基中，在恒温摇床上于27℃，180 r/min培养至OD600值为0.6～0.8。

②按1%～2%的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在以上相同的条件下培养6 h，当OD600值为0.2～0.5时即可用于转化，同时加入100～500μmol的AS。

3.3 侵染

将菌液倒入无菌小培养皿中，可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释。从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡1～5 min。取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。

3.4 共培养

将侵染过的外植体接种在愈伤组织诱导或分化培养基上(MS十IAA 0.5 mg/L BA 2.0 mg/L)，在28℃暗培养条件下共培养2～4 d。

3.5 选择培养

将经过共培养的外植体转移到加有选择压(以NPT－Ⅱ为标记基因时一般使用卡那霉素)的脱菌(附加250～500 mg/L的羧苄青霉素或头孢霉素，抑制农杆菌生长)分化或愈伤组织诱导培养基上，在光照为2 000～10 000 lx、25℃条件下进行选择培养。

3.6 继代选择培养与生根培养

选择培养2～3周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽或产生抗性愈伤组织，将这些抗性材料转入附加选择压(适量庆大霉素)的生长或分化培养基中令其生长或诱导分化。待不定芽长到1 cm以上时，切下并插入含有选择压的生根培养基上进行生根培养，2周左右长出不定根。

4 结果

将目的基因SAG－12成功转入矮牵牛茎尖中3次实验数据如表1所示。经过农杆菌介导的遗传转化，成功地得到了再生植株(见图2)，并在经过继代培养与生根培养后成功诱导出根系，得到再生植株。

表1 不同时期的矮牵牛茎尖数量的统计

图2 矮牵牛叶片转化后的再生植株

5 讨论

5.1 污染现象

该实验存在的染菌主要是真菌和细菌2类。这类污染通常是由环境不洁、培养基和培养材料消毒不彻底、操作过程中操作人员或工具带菌等引起［7－8］。细菌污染是指在培养过程中，在培养基表面或材料表面出现黏液状物体，以及菌落或浑浊的水迹状，有时甚至出现泡沫发胶状的现象［9］。本次实验出现的细菌污染主要是农杆菌。推测染菌的主要原因是农杆菌侵染后没有用无菌水洗净或者用滤纸吸干［10－11］。而真菌污染出现很快，一般接种后3～5 d就发现菌丝，继而很快出现黑、白、黄、绿等孢子。本试验真菌污染主要由封口膜破损以及实验员操作引起。

对于污染现象，可采取以下措施:①由于叶片染菌现象严重，实验材料改用无菌茎尖代替叶片进行转化，经过调整后效果比之前好［12］。②在操作过程中需要注意增强无菌意识。③在扩大繁殖材料时应严格检查和挑选，疑是被污染的材料一律不再用于繁殖。要用无菌水多次冲洗实验材料，直到水不再浑浊。④每次超净台使用前都要用紫外线杀菌20 min以上，再用75%酒精喷雾降尘;组培用的镊子和刀片都要彻底灭绝;双手洗净，每次出入超净台都必须用酒精喷雾杀菌。

5.2 褐化现象

褐化是指外植体或培养材料接种后在组织培养过程中，由于切割造成机械损伤，伤口处分泌出酚类化合物。在有氧的条件下，切面细胞中的酚类物质被多酚氧化酶催化，氧化为醌，醌再通过非酶促反应产生有色物质而导致组织褐变，变成棕褐色或暗褐色，并逐渐扩散到培养基中，抑制细胞内其他酶的活性，影响细胞的正常代谢，毒害整个组织，甚至导致组织死亡［13］。本实验矮牵牛外植体褐化现象非常严重。通常矮牵牛外植体培养不超过5 d即有部分会出现褐化现象。

对于褐化现象，可采取以下措施:①配置培养基时可以加入PVP、AC等以防止褐化。②每一个平板封2个封口膜防止破损，如发现霉菌污染应及时清除，并用加头孢类抗生素的无菌水冲洗数次。

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(责任编辑 何杰玲)

Research of Transform SAG12－IPT Gene in Petunia Hybrida

WANG Li1，ZHANG Xiao－wei2
(1.Xinhui Institute of Forestry Science，Jiangmen 529100，China; 2.Huazhong Agriculture University，Wuhan 430070，China)

As the short florescence，the high cost of replacing flowers has always been the bottleneck of the art of cut－flowers.The aim of this empirical study is，taking Petunia hybrida Vilm.for example，to overcome the disadvantages of short florescence and short cutting period using transgenicmethod and to provide the theoretical support for the research and development of transgenic flowers.This research can get regenerative transgenic plants after antibiotics’screening by transforming SAG12－IPT gene，a gene which could prolong the senescence of plants，into Petunia.

petunia;leaf senescence;SAG12;tissue culture

Q37

A

1674－8425(2014)09－0062－04

10.3969/j.issn.1674－8425(z).2014.09.014

2014－04－22

王立(1986—)，男，广东人，硕士，工程师，主要从事生物工程研究。

王立，张晓薇.矮牵牛转SAG12－IPT基因的研究［J］.重庆理工大学学报:自然科学版，2014(9):62－65.

format:WANG Li，ZHANG Xiao－wei.Research of Transform SAG12－IPTGene in Petunia Hybrida［J］.Journal of Chongqing University of Technology:Natural Science，2014(9):62－65.