郭书林 陈 垚 陈信忠 龚艳清 杨俊萍

（1.厦门出入境检验检疫局 福建厦门 361026；2.山东正大畜禽有限公司）

奥尔森派琴虫和北海派琴虫ITS基因测序及同源性分析

郭书林1陈 垚2陈信忠1龚艳清1杨俊萍1

（1.厦门出入境检验检疫局 福建厦门 361026；2.山东正大畜禽有限公司）

通过设计能扩增奥尔森派琴虫和北海派琴虫ITS序列的特异性引物，对我国东南沿海8个地区养殖牡蛎中常见的两种派琴虫相应基因进行扩增、克隆和测序，并进行同源性分析。国内不同地区奥尔森派琴虫ITS序列的同源性超过99.3％，与国外分离株的同源性也在98.8％以上；种间同源性分析发现，奥尔森派琴虫与海水派琴虫和P.honshuensis的同源性较高，分别为94.2％和95.0％，与P.qugwadi的同源性最低，仅62.9％。深圳和三亚分离的北海派琴虫ITS序列有18个碱基存在差异，其中ITS-1有3个碱基差异，ITS-2有15个碱基差异，而5.8S高度保守，没有碱基差异；北海派琴虫与其他种类之间的差异主要表现在ITS-1和ITS-2区域；同源性比较发现，北海派琴虫的同源性在100％-97.9％之间，其中深圳北海派琴虫的同源性较低，为97.9％。种间同源性分析表明，北海派琴虫与奥尔森派琴虫的同源性较高，为89.4％，其次为海水派琴虫和P.honshuensis，与P.qugwadi同源性最低，仅71.9％。

奥尔森派琴虫；北海派琴虫；ITS基因；同源性分析

1 前言

派琴虫(Perkinsosis)最先于1946年在美国墨西哥湾发病并大量死亡的美洲牡蛎(Crassostrea virginica)中被发现，其病原为之后命名的海水派琴虫(Perkinsus marinus)[1]，奥尔森派琴虫(P. olseni)是第2种被发现的派琴虫。2007年，在中国东南沿海养殖的近江牡蛎(Crassostrea hongkongensis)体内发现了一种新的派琴虫，被命名为北海派琴虫(P. beihaiensis n.sp)，进一步调查发现该地区还有其他一些牡蛎和贝类也是其易感宿主[2]。至今，国内外较认可的派琴虫有7种：海水派琴虫、奥尔森派琴虫、北海派琴虫、P. mediterraneus、P. qugwadi、P. honshuensis、P. chesapeaki，其中又以海水派琴虫、奥尔森派琴虫的流行最为广泛[3-5]。而我国发现的派琴虫则主要为奥尔森派琴虫和北海派琴虫，尚未发现海水派琴虫[6]。派琴虫呈世界性分布，感染牡蛎、花蛤、缢蛏、鲍鱼、扇贝等多种贝类，在许多国家和地区造成了严重损失。1954年以来，美国切萨皮克海湾的牡蛎因为感染派琴虫病，年产量由 19000 t下降至40 t[7]。

为了解派琴虫的种类及其演化规律，近年来许多学者开展了派琴虫种内遗传变异方面的研究，尤其是PCR 技术被广泛用于派琴虫的检测鉴定以及分子遗传学等方面。由于派琴虫核糖体DNA内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）为非编码基因区域，比较保守且进化速率较快，因此可以从不太长的序列中获得较多的信息[8]。目前在基因库（Genbank）中已有多个派琴虫ITS基因序列，但多数与奥尔森派琴虫和海水派琴虫有关，与其他种类派琴虫ITS序列有关的资料则很少，甚至还没有完整的ITS基因序列。本研究通过设计能扩增完整ITS序列的引物，对从我国东南沿海8个地区养殖牡蛎所分离的奥尔森派琴虫和北海派琴虫进行扩增、克隆和测序，并进行基因序列同源性分析。这些数据可以对派琴虫的系统发生和遗传变异提供参考，也可为发展可靠、准确和敏感的分子生物学诊断技术提供依据。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试验样品

2010-2011年，在福建省莆田市、泉州市、厦门市和漳州市漳浦县，广东省深圳市和广州市，海南省海口市和三亚市等沿海地区养殖太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）中培养分离并进行鉴定的阳性样本（奥尔森派琴虫和北海派琴虫），保存于-70℃。

2.1.2 试剂

海洋动物组织基因组D N A提取试剂盒、2×Tap PCR MasterMix PCR试剂盒、DNA 回收试剂盒、pMG-T克隆试剂盒、DNA Marke等试剂：购自北京天根生化科技有限公司。

2.1.3 主要仪器、设备

低温恒温槽：宁波天恒仪器厂；低温离心机：美国Bekman公司；PCR扩增仪：美国ABI公司；凝胶成像系统和电泳仪：美国Bio-Rad公司；微量核酸测定仪：德国拜发公司产品。

2.2 方法

2.2.1 引物的设计与合成

参照Genbank公布的派琴虫ITS全序列，以AY305326.1、AF509333.1、AF522321.2 、AF150990.1、U07701.1、U07698.1、XM_002784213.1等为模板，通过DNAMAN比对，运用Primer5.0设计多对能扩增多种派琴虫ITS1、ITS2和5.8S全序列的PCR通用引物。通过试验比较，本研究最终确定的引物为：ITS-F，5'-AACAAGGTTTCCGTAGGT-3'；ITS-R，5'-ATTCAGCGGGTAATCTCA-3'。引物由上海博尚生物技术有限公司合成，稀释至20 μM，-20 ℃保存备用。

2.2.2 样品总DNA提取

取待检牡蛎的鳃、外套膜、消化腺等组织共约100 mg，匀浆后根据海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA的提取。DNA产物于-20 ℃保存备用。

2.2.3 PCR扩增体系及反应条件的优化

采用20μL反应体系：PCR扩增体系含2×Tap PCR MasterMix 10μL，模板2.0μL，适量上下游引物ITS-F和ITS-R，补充ddH2O至20μL。

PCR反应条件的优化：退火温度优化范围为54℃-61℃，引物浓度从0.1-1μL，循环次数设置25、30、35、40次循环，确定最佳反应条件。

2.2.4 琼脂糖凝胶电泳分析

1.5 ％琼脂糖凝胶，120V电压电泳30min。凝胶于凝胶成像仪中观察，拍照并记录结果。

2.2.5 派琴虫ITS 扩增产物回收

将派琴虫ITS 扩增产物凝胶按DNA 回收试剂盒（离心柱型）操作说明回收扩增产物。

2.2.6 pMG-T载体的连接和转化

按照pMG-T克隆试剂盒操作说明连接和转化派琴虫ITS目的PCR片段与pMG-T载体。连接体系为10μL，载体与片段的摩尔比控制在1：3-1：8。转化后挑取白色菌落进行摇菌扩大培养，PCR检验后对阳性克隆菌液进行重组质粒提取。

2.2.7 ITS基因序列测定

提取的重组质粒经PCR鉴定为阳性后，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序，每个测序样本送3份，结果相同才被采用。

2.2.8 ITS序列及同源性分析

在Genebank中搜索国内外已经报告的各种派琴虫ITS全基因序列，将其与本项目获得的派琴虫ITS基因序列用MegAlign软件和与DNAMAN进行同源性分析。

3 结果与讨论

3.1 ITS序列 PCR反应条件优化及扩增结果

通过对反应条件的优化，最终确定反应条件为：ITS-F、ITS-R各0.5μL；PCR反应程序为94℃变性5 min，然后94℃ 1 min、57℃ 1 min、72℃ 1 min，共进行35个循环，最后72℃延伸10 min，于4℃保存。电泳结果表明，扩增产物长度介于750bp-1000bp之间，与实验设计相符（见图1）。

图1 派琴虫ITS电泳结果

3.2 重组质粒测序结果

测序结果表明：所设计的引物ITS-F和ITS-R能够有效扩增奥尔森派琴虫和北海派琴虫的ITS全序列，测序结果与Genbank中奥尔森派琴虫和北海派琴虫相应序列比对的同源性达98％以上。

3.3 奥尔森派琴虫的ITS序列及同源性分析

通过对福建莆田、泉州、厦门、漳浦、深圳、广州、海口和三亚等8个沿海地区所分离到的奥尔森派琴虫ITS序列进行多重序列比对发现，其ITS序列全长713 bp，其中ITS-1为183 bp，ITS-2 为371 bp，5.8S为159 bp。经统计上述地区分离的虫株ITS序列之间合计有11个碱基存在差异，其中ITS-1碱基差异有4个，ITS-2有7个，而5.8S高度保守没有碱基差异；将这些虫株与其他国家和地区的派琴虫ITS序列进行比对发现，5.8S区域碱基同样高度保守，而ITS-1和ITS-2的碱基存在较大差异，说明奥尔森派琴虫的ITS的三段序列中5.8S具有高度的保守性。实际上，奥尔森派琴虫与其他种类之间的差异主要表现在ITS-1和ITS-2区域(见图2)。

通过种内同源性分析，本次测序的8个地区奥尔森派琴虫ITS序列的同源性在100％-99.3％之间，变异范围为0.0％-0.7％；莆田和泉州，厦门和漳浦，海口和三亚奥尔森派琴虫的ITS序列的同源性均达99.9％以上；相比而言，深圳奥尔森派琴虫的ITS序列与其他地区的同源性较低，最低为99.3％；与世界其他国家和地区所分离的奥尔森派琴虫ITS完整序列比较分析发现，厦门和漳浦的虫株与韩国报告虫株(AF473840)的同源性达100％，其他虫株的种内同源性也在98.8％以上（见图3）；这些结果与Brown 等（2004）报道的基本一致[9]。种间同源性分析发现，奥尔森派琴虫与海水派琴虫和P. honshuensis的同源性较高，分别为91.7％-94.2％和93.8％-95.0％，与P. qugwadi的同源性最低，仅62.5％-62.9％（见表1）。

表1 各种派琴虫之间ITS基因的同源性比较(％)

图3 奥尔森派琴虫 ITS基因同源性比较

3.4 北海派琴虫的ITS序列及同源性分析

北海派琴虫的ITS序列全长738 bp，其中ITS-1 为196 bp，ITS-2为383bp，5.8S为159bp。经统计深圳和三亚的北海派琴虫ITS序列共计有18个碱基存在差异，其中ITS-1有3个碱基差异，ITS-2有15个碱基差异，而5.8S高度保守，没有碱基差异。与其他派琴虫的ITS序列进行比对后发现，5.8S的基因同样高度保守，而ITS-1和ITS-2的碱基存在较大差异，也证明北海派琴虫与其他派琴虫之间的差异主要表现在ITS-1和ITS-2区域 (见图2)。

将分离到的深圳和三亚北海派琴虫ITS全序列与Genbank中其他国家和地区北海派琴虫ITS序列做种内同源性比较发现，各地分离的北海派琴虫的同源性在100％-97.9％之间，同源性差异在0.0％-2.1％之间（见图4），而深圳北海派琴虫的同源性较低，最低为97.9％。种间同源性分析表明，北海派琴虫与奥尔森派琴虫的同源性较高，达87.5％-89.4％，其次为海水派琴虫和P. honshuensis，与P. qugwadi同源性最低，仅71.1％-71.9％（见表1）。

图 4 北海派琴虫ITS基因同源性比较

4 结论

（1）本研究利用设计的引物成功扩增了从我国东南沿海8个地区养殖牡蛎所分离的奥尔森派琴虫ITS序列。种内同源性方面，这些地区的派琴虫ITS基因序列同源性在100％-99.3％之间，其中深圳奥尔森派琴虫的同源性较低（99.3％），而与其他国家和地区相比，同源性也超过98.8％；种间同源性方面，奥尔森派琴虫与海水派琴虫和P.honshuensis的同源性较高，与P. qugwadi的同源性较低。。

（2）利用该引物也成功扩增了在深圳和三亚分离到的北海派琴虫的ITS全基因序列，弥补了目前基因库中没有北海派琴虫ITS全基因序列的空白。种内同源性方面，各地分离的北海派琴虫的同源性在100％-97.9％之间，其中深圳北海派琴虫的同源性较低（97.9％）；种间同源性方面，北海派琴虫与奥尔森派琴虫的同源性较高，达87.5％-89.4％，其次为海水派琴虫和P. honshuensis，与P. qugwadi同源性最低，仅71.1％-71.9％。

（3）深圳奥尔森派琴虫和北海派琴虫与其他在我国分离到的奥尔森派琴虫、北海派琴虫相比，其同源性较低，差异性较大，估计在长期的地理隔离和不同环境的影响下，奥尔森派琴虫和北海派琴虫在种内或种间形成独特的小群遗传品系。因此，获得派琴虫特定品系和位点的基因序列数据，对了解和掌握派琴虫的种内及种间变异情况具有重要意义。

［1］Ray S M. Historical perspective on Perkinsus marinus disease of oysters in the Gulf of Mexico[J]. Shellfish Res, 1996, 15： 9-11.

［2］Jessica A MOSS, Jie Xiao. Description of Perkinsus beihaiensis n. sp., a new Perkinsus sp. Parasite in Oysters of Southern China[J]. J Eukaryot Microbiol, 2008, 55(2)： 117-130.

［3］Ford S E. Range extension by the oyster parasite Perkinsus marinus into the North Eastern United States： response to climate change?[J]. Shellfish Res, 1996, 15： 45-56.

［4］Burreson E M, Alvarez R S, Martínez V V. Perkinsus marinus (Apicomplexa)as a potential source of oyster Crassostrea virginica mortality in coastal lagoons of Tabasco, Mexico[J]. Dis Aquat Org, 1994, 20： 77-82.

［5］Soniat T M. Epizootiology of Perkinsus marinus disease of eastern oysters in the Gulf of Mexico[J]. Shellfish Res, 1996, 15： 35-43.

［6］ 陈垚，陈信忠，郭书林. 3种牡蛎原虫的流行情况调查及多重PCR检测方法[J].福建农林大学学报，2012，41(4)： 509-513.

［7］Ulrich P N, Ewart J W, Marsh AG. Prevalence of Perkinsus marinus, Haplosporidium nelsoni (MSX), and QPX in Bivalves of Delaware’s Inland Bays and Quantitative, High-Throughput Diagnosis of Dermo by QPCR[J]. J Eukaryot Microbiol, 2007, 54(6)： 520-526.

［8］Chu K H, Li C P, Ho H Y. The first internal transcribed spacer (ITS-1) of ribo somalDNA as smo lecularmarker for phylogenetic and population an analysis in crustacea [J]. Mar bio technol, 2001, 3：355- 361.

［9］Brown G, Hudson K L, Reece K S. Genetic variation at the ITS and ATAN loci among and within cultured isolates of Perkinsus marinus[J]. Eukaryot Microbiol, 2004, 51： 312-320.

Sequencing and Homology Analysis of ITS Gene of P. olseni and P. beihaiensis

Guo Shulin1, Chen Yao2, Chen Xinzhong1, Gong Yanqing1, Yang Junping1
(1.Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen, Fujian, 361026; 2.Shandong Zhengda Livestock Co. Ltd.)

By desiging specifi c primers which can amplify ITS sequences of P. olseni and P. beihaiensis, Crassostrea gigas coming form 8 different farming areas were detected, cloned, sequenced and homology analyzed. The results showed that the ITS sequence homology of P. olseni was higher than 99.3％ in different areas of China, and higher than 98.8％ compared with foreign isolates. The interspecific homology analysis showed, P. olseni had a higher homology with P. marinus and P. honshuensis, were 94.2％ and 95.0％ respectively, and had the lowest homology with P. qugwadi, only 62.9％. The ITS sequences of P. beihaiensis isolated from Shenzhen and Sanya had 18 base differences, ITS-1 had 3, ITS-2 had 15, and 5.8s had no differences respectively. The differences of P. beihaiensis and other Perkinsosis were showed in ITS-1 and ITS-2 mainly. P. beihaiensis isolated from Shenzhen had lower homology, only 97.9％, since the range was 100％-97.9％. The interspecifi c homology analysis showed, P. beihaiensis had a higher homology with P. olseni, was 89.4％, followed by P. marinus and P. honshuensis, and had the lowest homology with P. qugwadi, only 71.9％.

P. olseni; P. beihaiensis; ITS Gene; Homology Analysis

S944.4

福建省自然科学基金项目（2012J05065）；国家质检公益专项项目（201210055）