马爱明??蒋曙光??黄铃??周建平

[摘要] 目的 用非离子型表面活性剂聚氧乙烯（10）油基醚（Brij97）制备可供注射的胰岛素液晶载体，达到缓释药物的目的。 方法 通过调节Brij97-十四酸异丙酯（IPM）-水体系水分含量形成低黏度的层状相（L2）用于注射，利用偏光显微镜对体系的相转变行为进行研究。 结果 选择Brij97-IPM-水（18︰2︰3）（10%IPM）和Brij97-IPM-水（4︰1︰1）（20%IPM）作为载药体系，研究胰岛素从体系中释放的动力学。胰岛素液晶载体在1h内即可吸收水分形成黏度较高的六角相液晶，水分吸收符合二级动力学方程。 结论 两种体系都可以延缓药物的释放，但药物从Brij97 -IPM-水（4︰1︰1）体系中释放更加缓慢，说明随着油脂性添加物的增加缓释能力逐渐增强。Brij97 -IPM-水体系有望成为多肽类药物缓释给药载体。

[关键词] Brij97；液晶；胰岛素；皮下注射；缓释

[中图分类号] TQ467.32 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）04-64-04

Brij97 based liquid crystalline for sustained subcutaneous delivery of insulin

MA Aiming JIANG Shuguang HUANG Ling ZHOU Jianping

Department of Pharmaceutics， China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China

[Abstract] Objective To develop non-ionic surfactant polyoxyethylene （10） oleyl ether（Brij97）fluid precursor formulations for subcutaneous injection as a strategy to sustain the release of insulin. Methods To study the phase transition behavior of these formulations， different content of water was added， the resulting systems were characterized by polarized light microscopy. Results Two formulations containing Brij97-IPM-water （18︰2︰3）（w/w， referred to as 10%IPM） Brij97-IPM-water（4︰1︰1） （w/w， referred to as 20%IPM） were chosen to study insulin release kinetic. Fluid precursor formulations were transformed into hexagonal phases in one hour after contact with water. Water uptake followed second-order kinetics. Conclusion Drug release is prolonged by the precursor formulations， but the release from 20%IPM is significantly lower than 10%IPM after 24h， This indicate that capacity of sustained release increased with the increase of lipophilic additive. These results suggest the potential of BRIJ-based precursor formulations for sustained insulin release.

[Key words] Brij97； Liquid crystal； Insulin； Subcutaneous injection； Sustained release

溶致液晶（lyotropic liquid crystal）是两亲性分子溶解于溶剂后形成的有序的热力学稳定状态，由于液晶在药用载体领域的巨大潜力，近年来不断受到关注[1]。构成溶致液晶的主要有糖脂类、磷脂类和烷基甘油酯[2]，其中研究最多的是单油酸甘油酯（GMO）-水和植烷三醇-水体系。溶致液晶体系在不同比例溶剂存在下可以形成各向同性胶束相（Lα）、层状相（L2）、六角相（HⅠ）、反向六角相（HⅡ）和立方相、反相立方相结构[1，3]。液晶可以增加药物稳定性，提高药物溶解度，并且由于液晶的黏度大，与生物膜具有良好的亲和性，因此也被用作生物黏附性材料，被应用于牙周、肠道、皮下等部位[4-5]。

基础胰岛素可使空腹状态下血糖保持正常水平。基础胰岛素的补充可以降低血糖水平波动，推迟糖尿病并发症的发生。研究表明，在1型糖尿病患者的治疗中消除基础胰岛素水平波动可以减少22%～54%的视网膜病变风险和60%的肾病变风险[6]。

在本实验中将选择Brij97作为液晶材料与油脂性的添加物（十四酸异丙酯（IPM））形成可供皮下注射的低黏度液晶相态，注射后形成高黏度的液晶相态，达到调节药物释放速度的目的。采用流变仪研究三种体系的黏度，考察三种体系的吸水溶胀动力学及药物在这三种体系中的体外释放情况。

1 材料与仪器

胰岛素（万邦医药），Brij97（上海宝曼生物有限公司），十四酸异丙酯（上海源叶生物有限公司，纯度大于98%），乙腈（上海凌峰化学试剂有限公司，色谱纯），无水硫酸钠（国药集团化学试剂，分析纯），吐温20（南京威尔化工有限公司），去离子水。高效液相色谱仪（P1201，大连依利特），偏光显微镜（Leica DMLP偏光显微镜，德国），博力飞流变仪（Brookfield DV-Ⅲ ULTRA，美国）

2 实验方法

2.1 胰岛素液晶载体的制备

将Brij97和IPM按比例精密称取，置于同一西林瓶中，在40℃条件下水浴加热熔融呈液态，用漩涡混合器混合均匀，加入一定量的水，在水浴条件下用漩涡混合器混合均匀，放至室温，即得。

2.2 胰岛素液晶载体黏度测定

为了确定胰岛素液晶在不同温度下的黏度，用博力飞流变仪测定液晶载体在20～40℃范围内黏度随温度的变化，样品和转子在恒温水浴后测量，测量的转子型号为SC4-16，剪切率为6s-1。

2.3 胰岛素液晶载体的溶胀动力学

为了确定胰岛素液晶载体吸收水分转变为六角相的时间和吸收水分的动力学，选择两种胰岛素液晶载体Brij97-IMP-水（9︰2︰3）和Brij97-IPM-水（4︰1︰1）作为样品。分别取上述样品，精密称取约300mg置于2mL离心管中（n=3），离心管底部用半透膜（透过分子量3500D，斯百全）封端，将离心管底部与过量去离子水接触，并置于37℃条件下保温，分别于0.5、1、2、5、7和12h取出离心管，用吸水纸出去底部多余水分，称重。将吸水后的样品置于偏光显微镜下观察，确定其微观结构[2]。将吸收水分百分率的数据与一级动力学和二级动力学方程进行拟合。

2.4 体外释放

2.4.1 胰岛素的含量测定 色谱柱：sinochrom ODS-BD（4.6×200mm，5μm，依利特）；流动相：0.2mol/L硫酸盐缓冲液（无水Na2SO4 28.4g，加水溶解，加磷酸2.7mL，用乙醇胺调节pH至2.3，加水定容至1000mL）-乙腈（74︰26）为流动相；流速1mL/min；柱温40℃；进样体积20μL。取系统适用性溶液（取胰岛素，用0.01mol/L盐酸溶液制成每毫升中约含40单位的溶液，室温放置至少24h），注入色谱仪，记录色谱图，胰岛素和A21脱氨胰岛素峰之间的分离度应不小于1.8。

2.4.2 体外药物释放测定 精密称取胰岛素液晶载体约300mg（胰岛素载药量0.5%）置于直径1cm的塑料管中，用半透膜（透过分子量8000～10000，上海蓝季）封口，放入盛有10mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液（添加0.2%吐温20）的离心管中，37℃恒温水浴，分别在4、6、8、12、24、36、48、60和72h取样300μL并补液[7]，样品照2.4.1下高效液相方法测定。

3 结果与讨论

3.1 胰岛素液晶载体黏度测定

外观照片见图1，黏度测定曲线见图2。从图1可以看出在注射前呈可流动的液态，而在与一定量的水分接触后，呈不流动的半固态。图2的黏度测定曲线可以看出，在20℃下，液晶的黏度要高于在37℃下的黏度，但是都处于较低水平，与Narayan Bhattarai等制备的PEG修饰壳聚糖原位凝胶的黏度相当[8]。

3.2 胰岛素液晶载体的溶胀动力学

Brij97液晶溶胀动力学结果见图3，由于液晶系统具有亲水和疏水基团，所以可以包裹不同大小和极性的药物分子，亲水性药物的释放主要是从亲水孔道扩散，扩散的速度取决于亲水孔道的曲折程度和孔道的大小，这和温度及脂质成分多少有关 [9]。图3所示为胰岛素液晶载体吸收水分的曲线图，对10%IPM和20%IPM处方吸收水分进行曲线拟合，拟合二级动力学的r2都达到0.98（P<0.05），符合二级动力学（表1）。从图3可以看出，随着IPM在体系中所占百分比的提高，体系吸收水分的速率明显降低，最大吸收百分比从150%左右降低到了80%附近，这对于亲水性药物的释放速度具有明显的影响。

图4所示为10%IPM和20%IPM胰岛素液晶载体与水分接触0.5、1、2和7h的偏光显微镜照片。在0.5h两者都是层状相，到1h时形成六角相，在7h处可见10%IPM样品出现了六角相和乳相共存（照片中的阴影部分为水包油形成的乳滴），而20%IPM样品仍然为六角相。

3.3 体外释放结果

胰岛素的体外释放结果如图5所示，其中三种处方都载有0.5%胰岛素，从图5可以看出三种处方的释放与IPM在体系中占有的分数呈负相关，Brij97-水（7︰3）的释放速度最快，Brij97-IPM-水（9︰2︰3）的释放速度其次，两者释放度都在24h分别达到了（83.1±2.7）%和（75.9±9.5）%，Brij97-IPM-水（4︰1︰1）的释放速度最慢，在24h时释放度才达到（34.9±2.5）%，到72h达到（82.1±5.5）%，说明可以通过调节添加物的含量改变胰岛素的释放速度。表2为体外释放数据的Higuchi方程拟合曲线，以累积释放度对释放时间的平方根进行线性回归，处方10%IPM和20%IPM的r2分别达到了0.97和0.98，符合Higuchi扩散方程，说明胰岛素从上述处方中释放主要是扩散的作用。

Asako Nishimura等[7]制备的胰岛素皮下注射凝胶在载药量为50IU/mL，制剂用量为200μL时，药物体外释放12h达到80%，动物实验证明在24h内可控制血糖浓度和波动水平；Qiu等[10]制备的微针冻干凝胶的载药量为3.75IU，7.5IU和15.0IU每针，在糖尿病小鼠的体内实验证明在12h内控制小鼠体内的血糖水平。本研究中胰岛素液晶载体的载药量为0.5%（w/w），制剂用量为300mg，药物体外在72h达到80%释放量，每日平均剂量与上述研究中的剂量相当，缓释时间较长。

释放介质的渗透压对于液晶吸收水分的速率和比例都具有较大的影响，可能延缓液晶内药物的释放速率，体内组织液与本研究选择的释放介质相比具有一定的胶体渗透压，对于皮下注射制剂的水分吸收和药物释放具有一定的影响，如孙佳丽等[11]发现渗透压不仅影响原位载药凝胶的水分含量而且对于药物的存在状态和释药曲线都有较大的影响。

Brij97是非离子型表面活性剂，一般认为是无毒无刺激的，但是对于高浓度（>20%）应用时可能具有潜在的刺激性和生物毒性。虽然与GMO、植烷三醇等亲脂性表面活性剂相比Brij97在体内更易于被溶解，但在体内的代谢排泄等方面仍然缺少文献资料，使Brij97的体内注射应用受到限制。由于Brij97液晶的渗透压较高注入皮下后吸收较多水分也可能引起刺激性。

由于材料本身的性质不一定完全符合制备、释放等方面的要求，可以向体系中加入少量添加物，这些客分子会被包裹进液晶中，从而达到改变液晶相态结构的目的。由于Brij97是亲水性材料表面活性剂，所以形成的液晶黏度较低且在体内易于消除，但也导致对亲水性药物释放过快的缺点。体外释放研究证明，亲脂性添加物的加入可以稳定Brij97液晶结构并增加其缓释能力，随着添加物加入量的增加，胰岛素的释放速度越来越慢，释放曲线越来越符合扩散模型，说明在过量水中Brij97液晶的稳定性增加，不再容易被水溶蚀。Brij97液晶可以在一定水分存在下形成在室温下呈液态的层状相，当注射入皮下和与水接触快速形成高黏度的半固态六角相，达到缓释药物的效果，Brij97液晶有望成为新的药物缓释载体。

[参考文献]

[1] 马坤，吴莲花，张敏燕，等.立方相液晶与六角相液晶作为药物载体的研究进展[J].药学进展，2012，36（1）：14-21.

[2] Rizwan S B，Hanley T，Boyd BJ，et al.Liquid crystalline systems of phytantriol and glyceryl monooleate containing a hydrophilic protein： characterisation， swelling and release kinetics [J].Journal of Pharmaceutical Sciences，2009，98（11）：4191-4204.

[3] 王仲妮.氧乙烯类表面活性剂在不同介质中溶致液晶等体系的性质研究[D].济南：山东大学，2005：9-10.

[4] 刘元芬，高缘，朱家壁，等.单油酸甘油酯/人工胃液体系形成液晶的性质研究[J].中国药学杂志，2011，46（23）： 1823-1827.

[5] 吴红兵， 霍东风， 蒋新国.脂质立方液晶纳米粒作为药物载体的研究进展[J].药学学报，2008，43（5）：450-455.

[6] Al-Tahami K，Oak M，Singh J. Controlled delivery of basal insulin from phase-sensitive polymeric systems after subcutaneous administration：In vitro release，stability，biocompatibility，in vivo absorption，and bioactivity of insulin[J].Journal of pharmaceutical sciences，2011，100（6）：2161-2171.

[7] Nishimura A，Hayakawa T，Yamamoto Y，et al.Controlled release of insulin from self-assembling nanofiber hydrogel，PuraMatrix?：Application for the subcutaneous injection in rats[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences，2012，45（1）：1-7.

[8] Bhattarai N，Ramay HR，Gunn J，et al.PEG-grafted chitosan as an injectable thermosensitive hydrogel for sustained protein release[J].Journal of Controlled Release，2005，103（3）：609-624.

[9] Phan S，Fong WK，Kirby N，et al.Evaluating the link between self-assembled mesophase structure and drug release[J].International journal of pharmaceutics，2011，421（1）：176-182.

[10] Qiu Y，Qin G，Zhang S，et al. Novel lyophilized hydrogel patches for convenient and effective administration of microneedle-mediated insulin delivery[J].International Journal of Pharmaceutics，2012，437：51-56.

[11] 孙佳丽，蒋国强，王玉杰，等.载药原位凝胶中水份随渗透压的变化及其对释药的影响[J].高校化学工程学报，2012， 26（4）：569-574.

（收稿日期：2013-12-10）

Brij97是非离子型表面活性剂，一般认为是无毒无刺激的，但是对于高浓度（>20%）应用时可能具有潜在的刺激性和生物毒性。虽然与GMO、植烷三醇等亲脂性表面活性剂相比Brij97在体内更易于被溶解，但在体内的代谢排泄等方面仍然缺少文献资料，使Brij97的体内注射应用受到限制。由于Brij97液晶的渗透压较高注入皮下后吸收较多水分也可能引起刺激性。

由于材料本身的性质不一定完全符合制备、释放等方面的要求，可以向体系中加入少量添加物，这些客分子会被包裹进液晶中，从而达到改变液晶相态结构的目的。由于Brij97是亲水性材料表面活性剂，所以形成的液晶黏度较低且在体内易于消除，但也导致对亲水性药物释放过快的缺点。体外释放研究证明，亲脂性添加物的加入可以稳定Brij97液晶结构并增加其缓释能力，随着添加物加入量的增加，胰岛素的释放速度越来越慢，释放曲线越来越符合扩散模型，说明在过量水中Brij97液晶的稳定性增加，不再容易被水溶蚀。Brij97液晶可以在一定水分存在下形成在室温下呈液态的层状相，当注射入皮下和与水接触快速形成高黏度的半固态六角相，达到缓释药物的效果，Brij97液晶有望成为新的药物缓释载体。

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[11] 孙佳丽，蒋国强，王玉杰，等.载药原位凝胶中水份随渗透压的变化及其对释药的影响[J].高校化学工程学报，2012， 26（4）：569-574.

（收稿日期：2013-12-10）

Brij97是非离子型表面活性剂，一般认为是无毒无刺激的，但是对于高浓度（>20%）应用时可能具有潜在的刺激性和生物毒性。虽然与GMO、植烷三醇等亲脂性表面活性剂相比Brij97在体内更易于被溶解，但在体内的代谢排泄等方面仍然缺少文献资料，使Brij97的体内注射应用受到限制。由于Brij97液晶的渗透压较高注入皮下后吸收较多水分也可能引起刺激性。

由于材料本身的性质不一定完全符合制备、释放等方面的要求，可以向体系中加入少量添加物，这些客分子会被包裹进液晶中，从而达到改变液晶相态结构的目的。由于Brij97是亲水性材料表面活性剂，所以形成的液晶黏度较低且在体内易于消除，但也导致对亲水性药物释放过快的缺点。体外释放研究证明，亲脂性添加物的加入可以稳定Brij97液晶结构并增加其缓释能力，随着添加物加入量的增加，胰岛素的释放速度越来越慢，释放曲线越来越符合扩散模型，说明在过量水中Brij97液晶的稳定性增加，不再容易被水溶蚀。Brij97液晶可以在一定水分存在下形成在室温下呈液态的层状相，当注射入皮下和与水接触快速形成高黏度的半固态六角相，达到缓释药物的效果，Brij97液晶有望成为新的药物缓释载体。

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[6] Al-Tahami K，Oak M，Singh J. Controlled delivery of basal insulin from phase-sensitive polymeric systems after subcutaneous administration：In vitro release，stability，biocompatibility，in vivo absorption，and bioactivity of insulin[J].Journal of pharmaceutical sciences，2011，100（6）：2161-2171.

[7] Nishimura A，Hayakawa T，Yamamoto Y，et al.Controlled release of insulin from self-assembling nanofiber hydrogel，PuraMatrix?：Application for the subcutaneous injection in rats[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences，2012，45（1）：1-7.

[8] Bhattarai N，Ramay HR，Gunn J，et al.PEG-grafted chitosan as an injectable thermosensitive hydrogel for sustained protein release[J].Journal of Controlled Release，2005，103（3）：609-624.

[9] Phan S，Fong WK，Kirby N，et al.Evaluating the link between self-assembled mesophase structure and drug release[J].International journal of pharmaceutics，2011，421（1）：176-182.

[10] Qiu Y，Qin G，Zhang S，et al. Novel lyophilized hydrogel patches for convenient and effective administration of microneedle-mediated insulin delivery[J].International Journal of Pharmaceutics，2012，437：51-56.

[11] 孙佳丽，蒋国强，王玉杰，等.载药原位凝胶中水份随渗透压的变化及其对释药的影响[J].高校化学工程学报，2012， 26（4）：569-574.

（收稿日期：2013-12-10）