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PI3K特异性抑制剂LY294002增强rsTRAIL蛋白对A549细胞的杀伤作用

2014-06-27方艳秋齐亚灵芦小单魏海峰

吉林大学学报(医学版) 2014年5期
关键词:蛋白组抑制率通路

刘 磊,方艳秋,齐亚灵,芦小单,魏海峰,谭 岩

(1.吉林省人民医院肿瘤生物治疗中心,吉林长春 130021; 2.佳木斯大学基础医学院组织学与胚胎学教研室,黑龙江佳木斯 154007)

PI3K特异性抑制剂LY294002增强rsTRAIL蛋白对A549细胞的杀伤作用

刘 磊1,方艳秋1,齐亚灵2,芦小单1,魏海峰1,谭 岩1

(1.吉林省人民医院肿瘤生物治疗中心,吉林长春 130021; 2.佳木斯大学基础医学院组织学与胚胎学教研室,黑龙江佳木斯 154007)

目的:探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)参与非小细胞肺癌A549细胞株抵抗重组可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rs TRAIL)蛋白诱导凋亡的机制,寻找增强rs TRAIL蛋白杀伤非小细胞肺癌细胞的新方法。方法:选取对数生长期A549细胞,随机分为rs TRAIL蛋白组和PI3K特异性抑制剂LY294002联合rs TRAIL蛋白(LY294002+rs TRAIL蛋白)组。MTT法检测2组A549细胞生长抑制率,流式细胞技术检测2组A549细胞周期和细胞凋亡的变化,蛋白质印迹法检测2组A549细胞中p-Akt(Ser473)、c-FLIPL、Bcl-2和Bax蛋白表达水平。结果:与rs TRAIL蛋白组(5.16%±0.32%)比较,LY294002+rs TRAIL蛋白组A549细胞生长抑制率(74.6%±2.63%)明显升高(P<0.05)。与rs TRAIL蛋白组比较,LY294002+rs TRAIL蛋白组处理2 h后G0/G1期A549细胞百分比增加(P<0.05),S期细胞百分比降低(P<0.05)。LY294002+rs TRAIL蛋白组A549细胞凋亡率为(61.50±3.02)%,显著高于rs TRAIL蛋白组(3.21%±0.96%)(P<0.05)。蛋白质印迹检测,与rs TRAIL蛋白组比较,LY294002+rs TRAIL蛋白组A549细胞中p-Akt、c-FLIPL和Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05),Bax/Bcl-2比值升高(P<0.05)。结论:LY294002能够抑制PI3K活性,增强rs TRAIL蛋白对A549细胞的杀伤作用。

癌,非小细胞肺;A549细胞株;肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体;磷脂酰肌醇3激酶;LY294002

肺癌是目前世界上严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤,发病率呈明显上升趋势,全球每年有超过百万人死于肺癌,其中85%死于非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。研究肺癌的发生、发展以及转移的分子机制,探索有效的靶向治疗手段具有重要的临床意义[1]。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)是一种天然的杀伤肿瘤细胞因子,被证实是唯一具有对正常组织细胞无毒性的抗肿瘤因子[2]。研究[3]显示:TRAIL可以抑制体外培养的NSCLC细胞增殖和SCID小鼠体内NSCLC细胞的生长。本文作者[4-5]获得的重组可溶性TRAIL(rs TRAIL)蛋白在抗NSCLC的应用研究中展现出了良好的抗肿瘤活性,然而肿瘤细胞内某些蛋白的异常表达和活化可以抑制TRAIL诱导的肿瘤细胞凋亡的发生,影响其在临床研究中的广泛应用。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白酶B(PI3K/Akt)信号转导通路的活化在人类恶性肿瘤中非常普遍, PI3K/Akt调控失调参与NSCLC细胞存活、增殖、抗凋亡和血管生成的各个环节,中断PI3K/Akt信号转导通路的转导可以增强药物对肿瘤细胞诱导凋亡的敏感性[6-7]。本研究选用PI3K特异性抑制剂LY294002对PI3K/Akt信号转导进行干预,观察参与TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡过程的c-FLIPL、Bcl-2和Bax蛋白表达的变化及A549细胞凋亡和增殖情况,探讨PI3K/Akt通路在NSCLC抵抗TRAIL耐药中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂A549细胞由吉林省人民医院中心实验室传代保存。rs TRAIL蛋白由吉林大学第一医院中心实验室表达纯化[2]。IMDM培养基、胰蛋白酶(美国Gibco公司),小牛血清(杭州四季青生物材料公司),四甲基偶氮唑蓝(MTT)(美国Sigma公司),LY294002(美国Calbiochem公司),抗p-Akt(Ser473)、抗Bcl-2、抗c-FLIPL、抗β-actin一抗和HRP标记抗鼠IgG或抗兔IgG二抗均为美国Cell Signaling Technology产品,细胞周期和细胞凋亡检测试剂盒购于贝克曼库尔特商贸有限公司。

1.2 MTT法检测细胞生长抑制率选取对数生长期的A549细胞,调浓度为5×105m L-1,接种于96孔板,每孔100μL。细胞贴壁后分别采用rs TRAIL蛋白(100 mg·L-1)作用12 h和20μmol·L-1LY294002作用不同时间(2、4、8 和16 h),再应用rs TRAIL蛋白(100 mg·L-1)作用12 h,每组设3个平行孔,每孔加入新配制的5 g·L-1MTT 20μL,37℃继续孵育4 h,弃上清后加150μL DMSO溶解,混匀后在490 nm波长处测定吸光度(A)值,计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)× 100%。

1.3 流式细胞术检测细胞周期选取对数生长期的A549细胞,调整浓度为5×105m L-1,接种于6孔板,每孔1 m L,待其生长至80%汇合时,采用20μmol·L-1LY294002作用1 h,收取单细胞悬液,用预冷的PBS洗涤2次,并用预冷的乙醇固定于4℃冰箱保存。PI染液(500μL/管),避光静置30 min后采用流式细胞仪检测细胞周期,分析各周期细胞百分率。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡选取对数生长期的A549细胞,调整浓度为5×105m L-1,接种于6孔板,每孔1 m L,待其生长至80%汇合时,采用20μmol·L-1LY294002作用2 h,加入100μg·L-1的rs TRAIL蛋白处理12 h,收取3孔细胞。同时以rs TRAIL蛋白单独处理组作为对照组。获得的单细胞悬液用PBS洗涤2次, Annexin-Ⅴ/FITC与PI匹配标记细胞,流式细胞术测定细胞凋亡率。

1.5 Western blotting法检测p-Akt、c-FLIPL、Bcl-2和Bax蛋白表达水平选取对数生长期的A549细胞,调整浓度为5×105m L-1,并接种于6孔板,每孔1 m L,待其生长至80%汇合时, 20μmol·L-1LY294002作用2 h,加入100μg·L-1rs TRAIL蛋白处理12 h,收取3孔细胞。同时以rs TRAIL蛋白单独处理组做为对照。收取细胞并采用裂解液获取总蛋白,测定各组细胞蛋白水平并将蛋白样品浓度调整为40 g·L-1。10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜2 h,10%脱脂奶封闭作用1 h。弃去封闭液,加入用封闭液稀释的一抗工作液(抗p-Akt、c-FLIPL、Bcl-2和Bax及抗β-actin抗体),4℃振摇孵育过夜。TBST洗膜3次,加入1∶3 000稀释的相应二抗,室温反应1 h;TBST洗膜3次,增强化学发光试剂显色,采用BandScan 5.0分析软件进行灰度分析,以目的蛋白条带灰度值与β-actin蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。

1.6 统计学分析采用SPSS 10.0统计学软件进行统计处理。细胞生长抑制率、各细胞周期A549细胞所占百分率、A549细胞凋亡率及p-Akt、c-FLIPL、Bcl-2和Bax蛋白表达水平以±s表示,组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 2组A549细胞的生长抑制率100 mg·L-1rs TRAIL作用A549细胞12 h后,细胞生长抑制率为(5.61±0.32)%;20μmol·L-1LY294002分别作用2、4、8和16 h后,再应用100 mg·L-1rs TRAIL蛋白作用12 h,A549细胞的生长抑制率分别为(74.6±2.63)%、(75.9±2.97)%、(76.7±2.84)%和(78.4±3.12)%;与rs TRAIL蛋白组比较,LY294002+rs TRAIL蛋白组A549细胞的生长抑制率明显升高(P<0.05)。

2.2 2组A549细胞的周期与rs TRAIL蛋白组比较,LY294002+rs TRAIL蛋白组G1期A549细胞百分率明显升高(P<0.05),S期细胞百分率明显降低(P<0.05)。见表1。

2.3 2组A549细胞凋亡率LY294002+rs TRAIL蛋白组A549细胞凋亡率为(61.5± 3.02)%,明显高于rs TRAIL蛋白组(3.21%± 0.96%)(P<0.05)。

表1 流式细胞术检测2组A549细胞周期Tab.1 Cell cycle of A549 cells detected by flow cytometry in two groups(±s,η/%)

表1 流式细胞术检测2组A549细胞周期Tab.1 Cell cycle of A549 cells detected by flow cytometry in two groups(±s,η/%)

∗P<0.05 compared with control group.

Group Percentage of A549 cells G1G2S rs TRAIL 54.12±2.46 13.54±2.23 32.34±1.75 LY294002+rsTRAIL 81.74±3.12∗7.07±1.59 11.19±1.26∗

2.4 2组A549细胞中p-Akt、c-FLIPL、Bcl-2和Bax蛋白表达水平与rs TRAIL蛋白组比较, LY294002+rs TRAIL蛋白组A549细胞中p-Akt、c-FLIPL和Bcl-2蛋白表达水平下调,Bax表达水平无明显改变。见图1。灰度分析结果:与rs TRAIL蛋白组比较,LY294002+rs TRAIL蛋白组p-Akt、c-FLIPL和Bcl-2蛋白表达水平下降(P<0.05),Bax/Bcl-2比值升高2.21倍(P<0.05)。见表2。

图1 2组A549细胞中p-Akt、c-FLIPL、Bcl-2和Bax蛋白表达电泳图Fig.1 Electrophoregram of expressions of p-Akt,c-FLIPL, Bcl-2 and Bax proteins in A549 cells in two groupsLane 1:LY294002+rs TRAIL group;Lane 2:rs TRAIL group.

3 讨论

目前化疗依然是NSCLC治疗的主要手段,但应用化疗治疗NSCLC(尤其是晚期患者)已经达到了平台期,为了进一步提高NSCLC的治疗效果,需要探索新的安全有效的临床用药。TRAIL能选择性地杀死肿瘤细胞,抑制动物体内移植瘤的形成与生长,而对大多数正常组织和细胞无明显毒性,耐药细胞株的出现限制了TRAIL抗肿瘤的应用范围[1,4-5]。

表2 各组A549细胞中p-Akt、c-FLIPL、Bcl-2和Bax蛋白表达水平Tab.2 Expression levels of p-Akt,c-FLIPL,Bcl-2,and Bax proteins in A549 cells in two groups(±s)

表2 各组A549细胞中p-Akt、c-FLIPL、Bcl-2和Bax蛋白表达水平Tab.2 Expression levels of p-Akt,c-FLIPL,Bcl-2,and Bax proteins in A549 cells in two groups(±s)

∗P<0.05 compared with rs TRAIL group.

Goup p-Akt/β-actin c-FLIPL/β-actin Bcl-2/β-actin Bax/β-actin Bax/Bcl-2 rs TRAIL 1.10±0.25 0.79±0.19 0.62±0.14 0.45±0.12 0.73±0.24 LY294002+rs TRAIL 0.17±0.09∗0.21±0.07∗0.33±0.10∗0.53±0.16 1.61±0.38∗

PI3K/Akt通路活化在人类恶性肿瘤中非常普遍,活化的PI3K/Akt通路可以激活下游多条信号通路的转导,促进NSCLC的发展和参与肿瘤的耐药[8]。LY294002为人工合成的小分子化合物,是PI3K/Akt信号通路的特异性抑制剂,通过共价结合到PI3K的赖氨酸残基,靶向抑制PI3K催化亚基p110的活化[9]。本课题组前期研究[4-5]结果表明:A549细胞内高表达c-FLIPL蛋白导致的Caspase-8活化抑制是细胞抵抗rs TRAIL蛋白诱导凋亡的重要原因,Willems等[10]研究发现:p-Akt是导致细胞内c-FLIPL蛋白水平升高的重要原因, Akt活化的特异性抑制剂能够降低c-FLIPL蛋白水平。本研究结果显示:PI3K靶向抑制剂LY290042能够抑制PI3K的活性从而降低p-Akt蛋白的表达水平,伴随着p-Akt蛋白表达水平的降低,c-FLIPL蛋白表达水平亦降低,rs TRAIL蛋白联合LY290042共同作用于A549细胞后细胞凋亡率明显升高,说明PI3K/Akt通路参与调节c-FLIPL蛋白对TRAIL诱导凋亡的抵抗作用。

PI3K/Akt通路是抑制细胞凋亡的中枢介质, p-Akt可以磷酸化凋亡蛋白的丝氨酸位点,改变其空间构象,阻止凋亡蛋白进入细胞核或者促进抗凋亡与之结合,从而抑制细胞凋亡。研究[11]证实: PI3K/Akt通路的激活可以导致Bcl-2蛋白表达水平升高,参与阻止TRAIL引起的线粒体细胞凋亡途径的激活。本研究结果显示:LY290042抑制p-Akt表达的同时,促进了Bcl-2蛋白表达降低,说明LY290042可能促进TRAIL激活的线粒体途径细胞凋亡能力。有关前列腺癌、直肠癌、白血病和宫颈癌等的临床研究[12-13]发现:Bcl-2家族成员的构成比例是凋亡调控的关键因素,尤其是Bax/Bcl-2比值是启动细胞凋亡的“分子开关”,直接决定了线粒体外膜各种通道的开放程度。外界因素刺激可以通过调节Bcl-2和Bax 2种调控因子的平衡改变细胞的命运。尽管Bcl-2和Bax的表达均可被Akt调节[14],但本研究结果显示:PI3K/ Akt抑制剂LY290042并未改变A549细胞中Bax的表达水平,但可以通过降低Bcl-2蛋白表达水平,增加Bax/Bcl-2比值,促进细胞凋亡信号的启动。

综上所述,20μmol·L-1LY290042作用2 h可以有效改善凋亡相关蛋白的表达水平,从2条凋亡途径增强TRAIL引起的肿瘤细胞凋亡作用;同时LY290042还可以增加G1期A549细胞的百分比,降低肿瘤细胞的增殖速度。G1期细胞的百分比增加可以增强TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的敏感性[15]。PI3K/Akt可以作为良好的靶点应用于NSCLC的治疗研究。

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Enhanced effect of rsTRAIL-based therapy for A549 cells by phosphatidylinositol 3′-kinase inhibitor LY294002

LIU Lei1,FANG Yan-qiu1,QI Ya-ling2,LU Xiao-dan1,WEI Hai-feng1,TAN Yan1
(1.Tumor Biological Treatment Center,Jilin Province People’s Hospital,Changchun 130021,China; 2.Department of Histology and Embryology,School of Basic Medical Science,Jiamusi University, Jiamusi 154007,China)

ObjectiveTo explore the potential mechanisms of non-small cell lung carcinoma cells to rs TRAIL protein-induced apoptosis by phosphatidylinositol 3′-kinase(PI3K/Akt)inhibitor LY294002,and to provide new ways to increase killing activities of rs TRAIL protein for non-small cell lung cancer.MethodsThe A549 cells at logarithmic growth phase were selected and randomly divided into rs TRAIL group and LY294002+rs TRAIL group.The inhibitory rate of growth of the A549 cells was tested by MTT assay.The cell cycle and apoptotic rate were detected by flow cytometry analysis.The expression levels of Ser473 phosphorylated form of Akt(p-Akt),c-FLIPLprotein and Bcl-2 protein in the A549 cells in two groups were analyzed by Western blotting method.ResultsThe inhibitory rate of growth of the A549 cells in LY294002+rs TRAIL group(74.6%±2.63%)was higher than that in rs TRAIL group(5.61%±0.32%)(P<0.05).Compared with rs TRAIL group,the percentage of the cells at G0/G1phase in LY294002+rs TRAIL group was increased(P<0.05)and the percentage of the cells at S phase was decreased(P<0.05).The apoptotic rate of the A549 cells in LY294002+rs TRAIL group(61.5%±3.02%)was higher than that in rs TRAIL group(3.21%±0.96%)(P<0.05).The Western blotting results showed that the expression levels of p-Akt,c-FLIPL and Bcl-2 proteins in the A549 cells in LY294002+rs TRAIL group were decreased(P<0.05)and the ratio of Bax/Bcl-2 was increased(P<0.05)compared with rs TRAIL group.ConclusionLY294002 can increase the killing activity of rs TRAIL protein in A549 cells by inhibiting the activity of PI3K.

cancer non-small cell lung;A549 cells;TNF-related apoptosis inducing ligand;LY294002;PI3K/Akt

R733.6

A

2014-01-21

吉林省科技厅基础项目资助课题(201115201);吉林省科技厅重点实验室项目资助课题(20122113);吉林省卫生厅科研基金资助课题(20082036);吉林省科技厅科技创新项目资助课题(20082102)

刘 磊(1978-),男,黑龙江省齐齐哈尔市人,医师,医学博士,主要从事肿瘤免疫相关研究。

方艳秋(Tel:0431-85595659,E-mail:yq.fang@163.com);齐亚灵(Tel:0454-8618297,E-mail:qiyaling87016@163.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-0972-05

10.13481/j.1671-587x.20140513

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