张 雯， 李宏杰， 贾 鸥， 张 艳， 刘 兰

(1.陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021； 2.华东医药集团， 浙江 杭州 311000)

0 引言

纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtilisnatto)是从日本传统食品纳豆中分离出来的菌种，俗称纳豆菌，是枯草芽孢杆菌的一个亚种[1,2].纳豆芽孢杆菌芽孢能耐酸、碱、高温及挤压，在酸性胃环境中能保持高度的稳定性[3-5]；纳豆菌在肠道中不增殖，只在肠道上段迅速发育转变成代谢活跃的营养型细胞，增强以厌氧菌为优势菌群的肠道正常菌群的生长，促进对营养物质的吸收，增强机体的免疫功能[6,7].纳豆菌不仅具有分解蛋白质、碳水化合物、脂肪等大分子物质的性能，使发酵产品中富含氨基酸、有机酸、寡聚糖等多种易被人体吸收的成分，而且在纳豆菌发酵纳豆的过程中还发现了一些生理活性物质，使纳豆具有多种保健功能，如抗肿瘤、降血压、抗菌等作用，还可预防骨质疏松、提高蛋白质的消化率、抗氧化等[8-10].纳豆菌发酵大豆生产的纳豆能产生具有溶栓活性的纳豆激酶，具有治疗三高(高血糖，高血压，高血脂)和溶解血栓的作用.目前，纳豆作为保健品及药品已日益受到人们的重视[11-14].然而，纳豆发酵用菌种还未见有商品形式出售，发酵菌剂的研究也未见有报道，这在很大程度上制约了纳豆的速酿及产品的推广.本研究利用具有优良生产性状的纳豆激酶生产菌株—纳豆芽孢杆菌进行高密度发酵，并进行纳豆芽孢杆菌菌剂制备，研究其生产工艺.为开发纳豆菌产品及纳豆速酿技术，促进纳豆的工业化生产及家庭使用，使纳豆成为价廉易得的保健食品奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtilisnatto)，陕西科技大学生命科学与工程学院实验室提供；种子培养基[15]蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，K2HPO40.02%，KH2PO40.02%，CaCl20.02%；普通发酵培养基[15]蛋白胨2%，葡萄糖 1%，K2HPO40.02%，KH2PO40.02%，CaCl20.02%，pH 7.0～7.2；固体培养基[15]蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，K2HPO40.02%，KH2PO40.02%，CaCl20.02%，琼脂2%,凝血酶(10 U/mg) 北京鼎国生物制品有限责任公司；标准纤维蛋白原(Fibrinogen，Sigma F-8630),北京拜尔迪生物公司；注射用尿激酶冻干粉(u-PA，2 500 IU/mg),辽宁天龙制药；黄豆,市售；其他试剂均为分析纯.

MG250B电热恒温培养箱、HYG-1A恒温振荡器,上海新瑞仪器有限公司；XPS-8CA光学显微镜,上海光学仪器有限公司；BS110S精密电子天平,北京赛多利斯天平有限公司；752型紫外分光光度计,上海光谱仪器有限公司；PHS-3C精密pH计,上海琅玕试验设备有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的制备

大豆浸汁培养基：黄豆以5倍水体积浸泡8～14 h，121 ℃～126 ℃，0.1～0.15 MPa处理1 h，滤除黄豆，取豆水，冷却调节pH至中性；大豆发酵培养基：黄豆以5倍水体积浸泡8～14 h，121 ℃～126 ℃，0.1～0.15 MPa处理1 h，滤除豆水，取黄豆.

1.2.2 纳豆激酶活力测定

纳豆激酶活力的测定方法见文献[16]和[17].

1.2.3 纳豆芽孢杆菌发酵培养基的优化

(1)普通发酵培养基与大豆浸汁培养基发酵纳豆芽孢杆菌的比较

制备普通发酵培养基、大豆浸汁培养基，分装于250 mL锥形瓶中(装液量30 mL/瓶)，接种纳豆芽孢杆菌种子液(接种量10%)，分别于37 ℃摇瓶培养10 h、12 h、14 h.600 nm下测定发酵液吸光值.每组试验3个平行.

(2)大豆酸水解对纳豆芽孢杆菌发酵的影响

按1.2.1所述方法制备大豆浸汁培养基，高温高压处理时介质分别为0.05%，0.1%，1%，3%，6%的HCl溶液，以水介质为对照.处理后的大豆浸汁培养基接种纳豆芽孢杆菌种子液(接种量10%)，分别于37 ℃摇瓶培养10 h、12 h、14 h.600 nm下测定发酵液吸光值，研究大豆酸水解工艺对纳豆芽孢杆菌发酵的影响.每组试验3个平行.

(3)大豆浸汁培养基配方的确定

制备大豆浸汁培养基，分别添加1%葡萄糖、3%葡萄糖、5%葡萄糖、0.02% K2HPO4、0.04%K2HPO4、0.06%K2HPO4，接种纳豆芽孢杆菌种子液(接种量10%)，37 ℃摇瓶培养14 h.600 nm下测定发酵液吸光值，对大豆浸汁培养基进行优化.每组试验3个平行.

1.2.4 纳豆芽孢杆菌发酵工艺优化

(1)温度对纳豆芽孢杆菌发酵的影响

制备优化大豆浸汁培养基，分装于250 mL锥形瓶中(装液量30 mL/瓶)，接种纳豆芽孢杆菌种子液(接种量10%)，分别于34 ℃、37 ℃、40 ℃摇瓶培养14 h.600 nm下测定发酵液吸光值，研究温度对纳豆芽孢杆菌发酵的影响.每组试验3个平行.

(2)pH对纳豆芽孢杆菌发酵的影响

制备优化大豆浸汁培养基，分装于250 mL锥形瓶中(装液量30 mL/瓶)，调节初始pH分别为pH6、pH6.5、pH7、pH7.5、pH8，接种纳豆芽孢杆菌种子液(接种量10%)，37 ℃摇瓶培养14 h.600 nm下测定发酵液吸光值，研究温度对纳豆芽孢杆菌发酵的影响.每组试验3个平行.

(3)发酵时间对纳豆芽孢杆菌发酵的影响

制备优化大豆浸汁培养基，分装于250 mL锥形瓶中(装液量30 mL/瓶)，接种纳豆芽孢杆菌种子液(接种量10%)，37 ℃摇瓶培养14 h.发酵过程中，每隔1 h取发酵液于600 nm下测定吸光值，绘制纳豆芽孢杆菌发酵曲线，确定纳豆芽孢杆菌发酵时间.每组试验3个平行.

1.2.5 保护剂对纳豆芽孢杆菌喷雾干燥的影响

利用上述优化工艺发酵纳豆芽孢杆菌，发酵液中分别添加β-环糊精、可溶性淀粉、蔗糖及脱脂奶粉4种物质作为保护剂，4种保护剂分别选取5%、10%、15%的浓度进行添加.利用喷雾干燥机对纳豆芽孢杆菌发酵液进行喷雾干燥，喷雾干燥进口温度为120 ℃，出口温度为60 ℃～70 ℃，收集固形物，即得纳豆激酶发酵菌剂.制备平板培养基，将菌剂进行悬浮稀释后进行平板培养，计算菌剂中活菌数含量，研究保护剂对纳豆芽孢杆菌喷雾干燥的影响.每组试验3个平行.

1.2.6 储存时间及条件对纳豆芽孢杆菌菌剂发酵活力的影响

采用上述优化工艺制备纳豆芽孢杆菌菌剂，分别于室温及4 ℃下储存0 d、5 d 、15 d、30 d、60 d，取适量菌剂活化并制备种子液，接种大豆发酵培养基，37 ℃静态发酵5 d得成熟纳豆，测定纳豆激酶活力，研究储存时间及条件对纳豆芽孢杆菌菌剂发酵活力的影响.每组试验3个平行.

1.3 数据处理方法

所有数据均用三次平行实验的平均值表示，用SPSS(PASW Statistics18)软件对数据进行处理，所有实验数据取3次平行试验的平均值，方差分析及多重比较中p<0.05为显著差异，记为*.

2 结果与讨论

2.1 普通发酵培养基与大豆浸汁培养基发酵纳豆芽孢杆菌的比较

普通发酵培养基与大豆浸汁培养基发酵纳豆芽孢杆菌的比较实验结果如图1所示.结果表明，大豆浸汁培养基发酵所得纳豆芽孢杆菌菌体浓度明显高于普通发酵培养基.大豆中含有丰富的大豆蛋白，各类脂肪，和棉籽糖、水苏糖等碳水化合物，维生素B1、维生素B2、烟酸等B族维生素，亚麻酸等不饱和脂肪酸以及多种微量元素.高温高压处理所得大豆浸汁能够为纳豆芽孢杆菌提供全面丰富的营养，使纳豆芽孢杆菌在培养过程中迅速增殖，达到较高的菌体浓度.同时制备大豆浸汁培养基过程中产生的蒸煮大豆可作为后续纳豆发酵原料，可以降低生产成本，适合于纳豆芽孢杆菌菌剂及纳豆发酵的工业化生产.

图1 大豆浸汁培养基与发酵培养基发酵纳豆芽孢杆菌细胞浓度比较

图2 大豆酸水解对纳豆芽孢杆菌细胞浓度的影响

2.2 大豆酸水解对纳豆芽孢杆菌发酵的影响

大豆酸水解对纳豆芽孢杆菌发酵的影响实验结果如图2所示.实验结果表明，采用不同浓度的盐酸溶液对大豆进行水解后所制得的大豆浸汁培养基发酵培养纳豆芽孢杆菌所得菌体浓度均较低，并且随着水解时盐酸浓度的升高，发酵所得纳豆芽孢杆菌菌体浓度呈显著下降的趋势.分析原因，可能是因为高温高压条件水解过程中，大豆中的营养成分已经能够充分游离出，经过盐酸水解后反而破坏了部分营养成分，同时水解过程中可能产生了毒副物质，抑制了纳豆芽孢杆菌菌体细胞的繁殖，因此大豆浸汁培养基制备时不采用酸水解处理.

2.3 大豆浸汁培养基配方的确定

2.3.1 葡萄糖加量对纳豆芽孢杆菌发酵的影响

大豆浸汁培养基中葡萄糖加量对纳豆芽孢杆菌发酵的影响结果如图3所示.实验结果表明，大豆浸汁培养基中添加葡萄糖能够促进纳豆芽孢杆菌菌体细胞的生长，葡萄糖浓度在5%以下时，随着葡萄糖添加量的增加，发酵液中细胞浓度呈上升趋势，葡萄糖浓度继续提高，大于5%时，菌体细胞浓度反而下降.说明大豆浸汁培养基中碳源含量不足，外源添加葡萄糖能够作为碳源促进细胞的增殖，但浓度太高时，导致培养基渗透压过高，使细胞出现质壁分离，不能正常繁殖.最终确定大豆浸汁中葡萄糖添加量为5%.

图3 葡萄糖加量对纳豆芽孢杆菌发酵的影响

图4 磷浓度对纳豆芽孢杆菌发酵的影响

2.3.2 磷含量对纳豆芽孢杆菌发酵的影响

大豆浸汁培养基中磷含量对纳豆芽孢杆菌发酵的影响结果如图4所示.实验结果表明，大豆浸汁培养基中添加磷酸盐能够促进纳豆芽孢杆菌菌体细胞的生长，K2HPO4含量在0.02%以下时，随着磷含量的增加，发酵液中细胞浓度呈上升趋势，磷含量继续提高，大于0.02%时，菌体细胞浓度反而下降.磷作为细胞内核酸、磷脂、能量等物质合成的重要原料，适量添加能够促进菌体细胞繁殖，但磷酸盐含量过高时，会对糖代谢过程中的酶产生抑制作用，从而影响细胞内正常代谢，影响细胞的繁殖.最终确定大豆浸汁中K2HPO4添加量为0.02%.

2.4 纳豆芽孢杆菌发酵工艺优化

2.4.1 温度对纳豆芽孢杆菌发酵的影响

温度对纳豆芽孢杆菌发酵的影响结果如图5所示.实验结果表明，37 ℃以下，随着发酵温度的升高，发酵液中细胞浓度呈上升趋势,当温度高于37 ℃时，发酵液中细胞浓度显著下降.细胞生长速率取决于化学反应速率以及酶活力的高低，随着温度的升高，化学反应速率提高，但当温度高于酶活最佳温度时，酶活力下降，导致细胞生长速率降低，影响细胞繁殖.纳豆芽孢杆菌发酵温度应选择37℃左右为宜.

图5 温度对纳豆芽孢杆菌发酵的影响

图6 pH对纳豆芽孢杆菌发酵的影响

2.4.2 pH对纳豆芽孢杆菌发酵的影响

pH对纳豆芽孢杆菌发酵的影响结果如图6所示.pH影响细胞内酶的催化活性，实验结果表明，纳豆芽孢杆菌发酵pH 在7.0左右时，发酵液中菌体细胞浓度最高.

2.4.3 发酵时间对纳豆芽孢杆菌发酵的影响

发酵时间对纳豆芽孢杆菌发酵的影响结果如图7所示.实验结果表明，发酵液中菌体细胞浓度随时间变化符合微生物细胞生长规律，发酵10 h时细胞浓度达最大值，之后进入平衡期.分别取发酵10 h和14 h的菌体细胞进行显微镜镜检.结果表明，发酵10 h时，可观察到大量杆状菌体细胞，纳豆芽孢杆菌基本以营养体形式存在，发酵14 h时，菌体细胞开始老化、断裂，芽孢开始出现，纳豆芽孢杆菌发酵时间应选择10 h左右为宜.

图7 发酵时间对纳豆芽孢杆菌发酵的影响

2.4.4 纳豆芽孢杆菌发酵工艺优化正交试验

以发酵初始pH、发酵温度、发酵时间为影响因素，按表1进行三因素三水平正交试验，确定各因素对纳豆芽孢杆菌发酵的影响，得到最优发酵工艺.

表1 正交试验因素水平表

正交试验结果如表2所示.实验结果表明，纳豆芽孢杆菌发酵最优工艺为A2B2C2.三个因素中，发酵初始pH和发酵温度影响显著，发酵时间超过8 h后，影响较小.各因素对纳豆芽孢杆菌发酵影响主次顺序为B>A>C，即发酵温度对纳豆芽孢杆菌发酵影响最大，其次是发酵初始pH，发酵时间最小.正交试验结果表明纳豆芽孢杆菌发酵最优工艺为：发酵初始pH7，发酵温度37 ℃，发酵时间10 h.最优组合A2B2C2不在正交试验表中，由此进行最优组合的验证试验.发酵初始pH7，发酵温度37 ℃，发酵时间10 h条件下，发酵液OD600为1.030，高于正交试验各次试验纳豆芽孢杆菌发酵液OD600，试验结果与正交试验结论一致.

表2 正交试验结果与分析

2.5 保护剂对纳豆芽孢杆菌喷雾干燥的影响

保护剂对纳豆芽孢杆菌喷雾干燥的影响结果如表3所示.实验结果表明，纳豆芽孢杆菌发酵液喷雾干燥过程中，添加保护剂对菌体细胞具有保护作用.不添加保护剂时，喷雾干燥后菌剂所含活菌数为41 CFU/g，添加保护剂后，菌剂中活菌数明显提高，5%脱脂奶粉作为保护剂喷雾干燥所得菌剂活菌数可达6.5×108CFU/g.蔗糖作为保护剂加入到发酵液中进行喷雾干燥时，随着温度升高逐渐焦化，几乎起不到保护作用.

表3 不同保护剂对菌剂喷雾干燥的影响

2.6 储存时间及条件对纳豆芽孢杆菌菌剂发酵活力的影响

储存时间及条件对纳豆芽孢杆菌菌剂发酵活力的影响实验结果如图8所示.实验结果表明，纳豆芽孢杆菌菌剂在25 ℃储存时，随着储存时间的延长，菌剂发酵产酶活力降低，表明菌剂发酵活力随着室温储存时间的延长呈下降趋势.这是因为常温条件下，菌体细胞仍继续繁殖，随着储存时间的延长，菌体细胞趋于老化，因此发酵活力降低.菌剂在4 ℃条件下储存120天以内，发酵活力变化不大，储存时间达180 d，发酵产酶活力可保持在2 000 IU/g以上.因此，纳豆芽孢杆菌菌剂宜冷藏储存180 d以内.

图8 储存时间及条件对纳豆芽孢杆菌菌剂发酵活力的影响

3 结论

通过对纳豆芽孢杆菌菌剂制备工艺进行研究，最终得出结论如下：

(1)纳豆芽孢杆菌发酵培养基：大豆浸汁培养基(黄豆以5倍水体积浸泡8～14 h，121 ℃～126 ℃，0.1～0.15 MPa处理1 h，滤除黄豆，取豆水，加入5%的葡萄糖和0.02%的K2HPO4，调节pH至7.0)；

(2)纳豆芽孢杆菌发酵工艺：发酵初始pH7.0，发酵温度37 ℃，发酵时间10 h；

(3)喷雾干燥保护剂：5%脱脂奶粉；

(4)菌剂储存：4℃冷藏180 d以内.

在上述工艺下所制得的纳豆芽孢杆菌菌剂活菌数为6.5×108CFU/g，发酵生产纳豆激酶性能良好.发酵生产纳豆激酶酶活为2 000～2 200 IU/g.参考文献

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