徐引弟，张青娴，李建林，张彬，王克领，朱文豪

（河南省农业科学院畜牧兽医研究所，郑州450002）

PEDV、TGEV、RV多重RT－PCR检测方法的建立与应用

徐引弟，张青娴，李建林，张彬，王克领，朱文豪

（河南省农业科学院畜牧兽医研究所，郑州450002）

为了快速准确诊断猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（RV）引起的猪腹泻病，通过设计三对引物，建立了扩增PEDV、TGEV、RV的多重RT－PCR方法，用于临床上大量腹泻病料的鉴定。该方法特异敏感，能同时检测PEDV、TGEV、RV，而对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型病毒、乙型脑炎病毒、猪细小病毒等无扩增，检测的抗原稀释极限为107。用于35个猪场120份临床样品的检测，PEDV阳性率占37.5%，TGEV阳性率占0.75%，RV阳性率占1.25%。PEDV阳性病料测序结果分析表明，与近几年分离毒株亲缘关系较近，与经典毒株和疫苗株亲缘关系较远。结果表明建立的多重PCR方法特异性强、敏感度高，能用于临床诊断及流行病学调查。

猪流行性腹泻病毒；猪传染性胃肠炎病毒；猪轮状病毒；多重RT－PCR

2010年10月以来，我国大部分地区大部分猪场爆发一种以哺乳仔猪水样腹泻、呕吐、高发病率和高死亡率为主要特征的猪病。此次疫情导致超过数百万头仔猪的死亡，一周龄以内的仔猪发病率几乎100%，死亡率高达80%～100%，传统的控制策略对当前的腹泻病控制效果不明显，这次疫情持续时间长，给中国养猪户及养猪业造成了灾难性的打击［1－3］。经过国内外专家学者几年不懈的努力，对引起此腹泻病爆发的病原有了较为清晰的了解。引起此次严重腹泻的病原主要是变异的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、猪轮状病毒（porcine group A rotavirus，RV）等。其中PEDV是最为主要的病原［4－5］。由于PEDV、TGEV、RV三种病的临床表现、流行病学、病理变化等极其相似，临床上很难区分，必须借助实验室诊断，如病毒分离、免疫荧光、PCR等。PCR技术快速、特异、敏感，因此是快速诊断鉴别这三种疾病的首选。为了更加省时、省力、准确，在传统的单一PCR的基础上，本试验建立了一种更加快速、特异、简便的检测PEDV、TGEV、RV的多重RT－PCR方法，并应用于河南及周边地区发生腹泻的猪场的检测，为腹泻病的研究和防制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验毒株及病料 猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒三联弱毒疫苗购自哈尔滨维科生物技术公司（中试）。猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型病毒（PCV2）、乙型脑炎病毒（JEV）、猪细小病毒（PPV）阳性病料由本室保存。腹泻病料主要采自河南及周边地区山西、河北等发生腹泻猪场的肠道、粪便，即用、－20℃或－70℃保存。

1.2 工具酶及试剂 Total RNA提取试剂盒RNAiso Reagent、反转录酶M－MLV、RNA酶抑制剂、pMD－18T、rTaq酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker、DEPC灭菌水等均购自宝生物工程（大连）有限公司，Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒、Taq PCR Master Mix购自上海生工工程公司。

1.3 疫苗及病料的处理 所有接触RNA的耗材如剪刀、镊子、注射器、EP管、吸头、匀浆器等均经0.1%DEPC水处理后灭菌烘干。疫苗按说明稀释，反复冻融3次，取100 μL上清。对于腹泻病猪肠道、粪便、CSFV、PRRSV、JEV等样品，取约0.5 g，剪碎，加1 mL无菌PBS匀浆，－70℃反复冻融3次，8000 r／min离心5 min，取100 μL上清于1.5 mL EP管中备用。

1.4 总RNA、DNA的提取 取上述上清液100 μL，按照RNA提取试剂盒操作说明提取总RNA，融于30 μL DEPC灭菌水。对PRV、PCV2、PPV阳性病料DNA提取参照Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒说明，最后融于50 μL灭菌水。

1.5 引物设计 参考文献［6－8］报道的方法以及Genbank中的序列，设计三对引物。PEDV引物序列上游P1：5’－TTTATTCTGTCACGCCAT－3’；下游P2：5’－AGATTTACAAACA CCTATGTTA－3’；扩增产物长度为199 bp。TGEV引物序列上游P3：5’－TATTTGTGGT TTTGGTTATAATGC－3’；下游P4：5’－GGCTGTTTGGTAACTAATTTRCCA－3’；扩增产物长度为886 bp。RV引物序列上游P5：5’－GTATGGTATTGAATATACCAC－3’；下游P6：5’－GATCCTGTTGGCCATCC－3’；扩增产物长度为342 bp。引物由上海生工合成。

1.6 单一RT－PCR方法的建立 10 μL反转录体系：5×M－MLV buffer 2 μL、dNTP（10 mM／L）0.5 μL、分别加入P2（10 μM／L）1 μL、P4（10 μM／L）1 μL、P6（10 μM／L）1 μL、RNase酶抑制剂（40 U／μL）0.25 μL、M－MLV反转录酶（5 U／μL）0.25 μL、疫苗总RNA 10倍倍比稀释后取5 μL为模板，加DEPC灭菌水至10 μL，37℃水浴1 h，即用或－70℃备用。

25 μL PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5 μL、dNTP（10 mM／L）0.5 μL、P1、P2（10 μM／L）各0.5 μL、rTaq酶0.5 μL、cDNA 2 μL，加灭菌水至25 μL。PCR循环体系：95℃预变性5 min，进入循环，94℃30 s，53℃30 s，72℃30 s，35个循环后，72℃延伸5 min，结束后取10 μL用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳。TGEV、RV的反应体系和循环体系同PEDV。对CSFV、PRRSV、JEV病料的RNA参照腹泻病料进行反转录和PCR，对PRV、PCV2、PPV阳性病料DNA用PCR检测。

1.7 多重RT－PCR方法的建立 参照单一PCR，在反转录体系中同时加入P2、P4、P6，模板以单一PCR结果均清晰为依据加入适合稀释倍数，PCR反应体系中同时加P1、P2、P3、P4、P5、P6三对引物进行PCR反应。

1.8 RT－PCR的应用 所建立的多重RT－PCR用于临床发病猪120份病料的检测。

1.9 阳性病料的序列分析 参照Genbank KF484734序列，针对PEDV S基因设计一对引物，上游引物P7：5’－CATACTAAAGTTGGTGGGAA－3’，下游引物P8：5’－CTGAGTCATGAACAGCCAAT－3’，扩增产物长度为894 bp。对PEDV扩增阳性的病料用P7、P8扩增，扩增产物连接pMD－18T载体，测序并分析。

2 结果

2.1 单一RT－PCR方法的建立 分别以P2、P4、P6反转录，分别以P1＋P2、P3＋P4、P5＋P6进行PCR，结果从疫苗中分别扩增出约199 bp、886 bp、342 bp片段。总RNA稀释至107倍，条带仍清晰（图1）。说明三种PCR敏感性高。三对引物扩增CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、JEV、PPV阳性病料均为阴性，说明引物的特异性较好（图2）。2.2 多重RT－PCR方法的建立 在反转录体系中同时加入P2、P4、P6，模板104倍数稀释，PCR反应体系中同时加三对引物。多重RT－PCR结果如图3。

图1 PEDV、TGEV、RV的RT－PCR敏感性检测

图2 PEDV、TGEV、RV的RT－PCR特异性检测

图3 PEDV、TGEV、RV的多重RT－PCR

2.3 多重RT－PCR的应用 共采集来自35个猪场的120头猪的样品。结果PEDV阳性猪45份，占37.5%；TGEV阳性猪9头，占0.75%；RV阳性猪15头，占1.25%；其中PEDV、TGEV混合感染的有5份，占4.17%；PEDV、RV混合感染的有8份，占6.67%；没有检测出同时感染3种病毒的样品。

2.4 阳性病料的序列分析 用引物P7、P8扩增阳性病料，扩增出预期大小片段（图略）。序列命名CHHN2014。通过Blast比较，CHHN2014与CHXY－02株S基因序列（Genbank NO.KF484734）2012年河南毒株100%同源，与国内其他分离株同源性均在99%以上，与美国2013年分离株同源性均在98.43%以上。与韩国2013年分离毒株同源性在98.43%以上。与经典疫苗株CV777（AF353511）32个碱基变异，同源性为96.42%。序列分析结果表明与PEDV变异株同源性较高。系统进化树分析（图4）表明CHHN2014与国内近2年分离毒株亲缘关系最近，与越南2013年毒株（VN／KCHY－310113／2013／KhoaiChau／HungYen／Vietnam）、美国2013年毒株（USA／Minnesota52／2013）、韩国2013年毒株（KNU－1305）亲缘关系较近，而与泰国2008年毒株（NPPED2008＿2）、韩国1997年毒株（KPEDV－9）以及疫苗株CV777亲缘关系较远。

图4 PEDV阳性病料扩增的S基因的序列进化树

3 讨论

自2010年10月份以来，猪腹泻病在我国呈现流行区域广、流行强度大、危害十分严重。对很多地方的哺乳仔猪造成了毁灭性的打击，给我国的生猪产业造成了极大的经济损失。传统的疫苗防疫效果较差，返饲效果较差，药物治疗效果较差。2011年开始，一些报道存在PEDV变异毒株，这些变异毒株很可能是造成本次我国腹泻流行的罪魁祸首［9－11］。

本文建立的PEDV、TGEV、RV的多重RT－PCR检测方法，简单特异，从样品检测的结果看，腹泻猪场中PEDV的阳性率37.5%，比例较高，说明PEDV的感染率较高，危害十分严重，是本次疫情的主要病原。通过对PEDV阳性病料的测序及序列分析结果看，PEDV存在变异，与2008年以前的毒株以及疫苗株差异较大，而与近几年国内外毒株同源性较高［12－14］。除PEDV外，在腹泻病料中，也检测出传染性胃肠炎病毒和轮状病毒的感染，但比例稍低，并且有2种病毒混合感染的情况，进一步加重死亡的比例。

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（编辑：陈希）

Establishment and Application of Multiple RT－PCR Method for Diagnosis of PEDV，TGEV and RV Infection

XU Yin－di，ZHANG Qin－xian，LI Jian－lin，ZHANG Bin，WANG Ke－lin，ZHU Wen－hao
（Institute for Animal Husbandry and Veterinary Research，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China）

In order to establish a rapid and accurate method for diagnosis of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV），porcine transmissible gastroenteritis virus（TGEV），porcine rotavirus（RV），three pairs of primers were designed and a multiple RT－PCR method to amplify PEDV，TGEV and RV was developed.The method is specific and sensitive and can be used simultaneously to detect PEDV，TGEV，RV，and can，tdetect CSFV，PRRSV，PRV，PCV2，JEV and PPV.The detection limit of antigen dilution was 107.For 120 clinical samples from 35 pig farms，PEDV positive rate with diarrhea accounted for 37.5%of diarrheal diseases material.TGEV positive rate was 0.75%and RV positive rate was 1.25%.Sequencing analysis of PEDV positive disease material shows that，it has closer relationship with isolates strains in recent years，than with classical strain and vaccine strain.The result showed that this multiple RT－PCR method was high sensitive，high specific and can be used in clinical diagnosis and epidemiological investigation.

PEDV；TGEV；RV；multiple RT－PCR

2014－07－09

A

1002－1280（2014）11－0010－04

S852.65

河南省农业科学院自主创新基金项目（2013ZZ30）

徐引弟，博士，副研究员，从事动物病原微生物方面研究。E－mail：445177674＠qq.com