高彦华，陈 颖

(东北石油大学化学化工学院 石油与天然气化工省重点实验室，黑龙江 大庆 163318)

茶多酚是从茶叶中提取的多酚类活性物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒、降血脂、防辐射等多种重要的生物活性，被广泛应用于医药、食品和化妆品等领域。其中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶多酚中的主要生物活性成分，是目前科研和产品开发的热点[1-5]。因此，茶多酚的提取及EGCG的纯化研究已受到广泛关注。

作者前期研究[6]表明，采用硅胶进行柱层析可以对茶多酚及EGCG的分离取得较理想的效果，柱层析系统中，柱塞泵的驱动力可大大缩减分离周期，提高分离效率。但是，对环境造成污染，同时也给混合溶剂的回收带来困难，操作也比较繁琐。交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)是一种不溶于水、强酸、强碱及一般有机溶剂的交联聚合物。作为一种重要的高分子精细化工产品，PVPP是一种无毒、无刺激性、安全稳定的聚合物，具有很强的选择吸附能力，能够通过羰基与多酚类物质形成氢键络合物[7-8]。因此，作者在前期工作的基础上，以PVPP为填料，以丙酮为洗脱剂，研究了连续中压柱层析对茶多酚及EGCG的分离和纯化，取得了令人满意的效果，缩短了生产周期，克服了敞口常压柱层析生产周期长,分离效果差,且易逸出有机溶剂蒸气污染环境等不足,减少了对环境造成的污染，大大降低了生产成本。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

PVPP：分析纯，北京中生瑞泰科技有限公司；EGCG等标准品：质量分数均高于98%，美国Sigma公司；色谱检测试剂乙腈、乙酸乙酯、硫酸：色谱纯，美国DimaTechnology Inc公司；TLC色谱板：硅胶HF254，上海源叶科技有限公司。

连续不锈钢中压层析系统：玻璃层析柱根据文献[6]自制，柱长1 500 mm，内径200 mm，耐压20 MPa；2J-X16/15柱塞式计量溶剂泵：杭州之江科学仪器厂；层析仪：自制；SHB-IIIG循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；R201D旋转薄膜蒸发器：上海申胜公司；D99型台式高速微型离心机：宁波新芝科器研究所；LC-1500高效液相色谱仪：1580泵，UV- 1575紫外检测器，日本Jasco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取液的制备

茶多酚提取液根据文献[9-10]从新鲜老龄绿茶叶中提取，并经过膜分离处理得反渗透膜浓缩的茶多酚提取液。其中w(茶多酚)=41.05%，w(EGCG)=17.16%。

1.2.2 静态吸附解吸过程

称取一定量的PVPP加入适量去离子水充分溶胀后去水[w(水)=12%，下同]，加入茶多酚提取液，常温下于摇床中充分吸附，加入除杂剂除杂质后，加入洗脱剂洗脱，浓缩得浓缩液。取样，离心分离，检测w(EGCG)。

1.2.3 动态吸附解吸过程

1.2.3.1 层析柱装填

称取一定量溶胀后PVPP(以绝干质量计，下同)于层析柱内，使PVPP均匀填满整个柱体不留死体积，用砂芯板和法兰封口，将层析柱安装至层析仪上，氮气加压，用柱塞泵泵入洗脱液以一定流速淋洗直至柱平衡。

1.2.3.2 动态吸附解吸条件的确定

室温下泵入茶多酚提取液，以一定流速通过层析柱，进行动态吸附实验，测定流出液中w(EGCG)，绘制出PVPP的动态吸附曲线。同时，考察洗脱流速对PVPP解吸性能的影响，确定最佳的解吸条件。

1.2.3.3 柱层析纯化过程

称取一定量的茶多酚提取液，用柱塞式溶剂泵进液，除杂剂除杂质后，洗脱液洗脱，洗脱液分段收集，TLC及HPLC检测，合并，减压浓缩回收洗脱液。低纯度组分收集后作为层析原料再次纯化。有效成分经检测全部流出后，层析柱经再生处理后可再次上样，反复使用。

1.2.4 w(茶多酚)、w(EGCG)及w(咖啡因)的分析方法

w(茶多酚)测定采用GB8313—87分析检测；w(EGCG)采用文献[7]提供的高效液相色谱法(HPLC)分析；w(咖啡因)采用GB8312—87分析检测。

2 结果与讨论

2.1 静态吸附结果

2.1.1 m(PVPP)对吸附效果的影响

称取1～8 g PVPP，分别加入150 mL茶多酚提取液[ρ(EGCG)=10.01 mg/mL，下同]，于摇床中充分吸附，考察m(PVPP)对吸附效果的影响，结果见图1。

由图1可知，m(PVPP)越大，EGCG吸附率越大。但当m(PVPP)>6 g时，EGCG吸附率增大不明显，考虑到经济因素以及方便后处理，确定PVPP最佳用量为6 g，即每克PVPP吸附EGCG0.25 g。

m(PVPP)/g图1 m(PVPP)对吸附效果的影响

2.1.2 PVPP静态吸附动力学曲线

称取6 g PVPP加入150 mL茶多酚提取液，于摇床中进行吸附60 min。每10 min取样检测，PVPP对EGCG的吸附动力学曲线见图2。

t/min图2 PVPP的静态吸附动力学曲线

由图2可知，随吸附时间的增加，EGCG吸附率逐渐增加，但当吸附时间超过30 min后，其EGCG吸附率增加不明显，因此，确定最佳的吸附时间为30 min。实践证明，较短的平衡时间为PVPP的工业应用提供了理论基础。其吸附前后萃取液HPLC谱图对比见图3和图4。

t/min图3 吸附前溶液高效液相色谱图

t/min图4 吸附后溶液高效液相色谱图

由图3、图4对比分析可知，EGCG能够有效地被吸附，咖啡因吸附少量，大部分残留在吸附后的溶液中而被除去。因此，选用PVPP吸附，效果较理想。

2.1.3 EGCG的吸附等温线的测定

称取6 g PVPP 5份，分别加入150 mL茶多酚提取液于摇床中吸附30 min，考察不同温度的吸附效果，结果见图5。

t/℃ 图5 EGCG的吸附等温线

由图5可知，PVPP对EGCG的吸附效果随温度的升高虽表现为先增大后减少的趋势，但相对较缓慢。分析其原因为当温度升高，一方面分子热运动加快，增加了PVPP与EGCG分子间的碰撞几率，有利于吸附反应的进行。同时高温有利于解吸反应，不利于吸附反应，因此也使EGCG吸附率下降。2种因素的结合效果说明，当温度在25～45 ℃，吸附速率的增大速度比解吸速率的增大速度快，EGCG的吸附率增大。当温度高于45 ℃时，解吸速率增大速度比吸附速率的增大速度快，EGCG的吸附率下降。从图5显示的结果也可以看出，当温度25～45 ℃时，吸附率增加不明显，考虑到节省能耗因素，采用常温条件作为PVPP与EGCG吸附的温度。

2.1.4 除杂剂的筛选

考虑到待分离的提取液中含有较多的色素、咖啡因、糖类、蛋白以及其它极性大的杂质，首先选择了常用的经济适用且绿色无污染的去离子水。另外考虑了极性较大的不同体积分数的甲醇、乙醇及丙酮，通过HPLC跟踪检测发现，低体积分数的上述3种溶剂虽可不同程度除去杂质，但在后续的EGCG洗脱过程中即使选用高浓度甲醇和乙醇这2种溶剂，EGCG洗脱率均较低，而考虑到后续过程不宜再增加新溶剂，尽量选择同一类除杂剂及洗脱剂，选择了低体积分数丙酮进一步除杂。

取6 g按上述最佳吸附条件吸附后的PVPP，加入120 mL去水离子水水洗，水洗液HPLC谱图见图6，加入φ(丙酮)=10%丙酮溶液250 mL洗脱，洗脱液HPLC谱图见图7。

t/min图6 水洗液高效液相色谱图

t/min图7 φ(丙酮)=10%洗脱液高效液相色谱图

由图6可知，水洗能够将吸附在PVPP上的色素、咖啡因、糖类以及蛋白等杂质部分除去，同时还将溶于水的极性较大的杂质部分除去。由图7可知，φ(丙酮)=10%的丙酮溶液不仅能够将水洗未完全除去的咖啡因除去，而且能够将一部分极性较大的杂质、色素部分除去，达到进一步纯化的目的。

2.1.5 洗脱液体积分数的确定

称取32 g PVPP分成4等份，按上述方法吸附以及除杂后，向每份内分别加入不同丙酮溶液各600 mL进行洗脱，洗脱液离心，减压浓缩，浸膏干燥至质量恒定，HPLC检测，计算EGCG回收率及质量分数，结果见图8。

φ(丙酮)/%图8 不同φ(丙酮)洗脱效果对比

由图8可知，不同φ(丙酮)对EGCG的洗脱率是不同的，其中φ(丙酮)=90%时丙酮洗脱回收率最高为86.21%。从质量分数来看，4种体积分数的洗脱剂洗脱产品质量分数相仿，均约为53%，因此，在保证w(EGCG)相差不多的情况下，尽量选择洗脱EGCG总量多的φ(丙酮)，因此确定最佳洗脱剂为φ(丙酮)=90%。

2.2 动态吸附解吸附条件的确定

将提取液分别控制不同流速进行动态吸附，确定最佳上样流速；再用水、φ(丙酮)=10%丙酮溶液以及φ(丙酮)=90%丙酮溶液分别采用不同流速连续通过层析柱洗脱，计算出回收率，然后以流速为横坐标、吸附率和回收率为纵坐标作图，结果见图9。

流速/(mL·min-1)图9 不同流速对EGCG的吸附率及回收率的影响

由图9可以看出，随着流速的增加，PVPP对EGCG的吸附率及回收率均有所降低，流速越低吸附率和回收率越高，但流速过低将导致吸附解吸过程周期过长，因此建议以30 mL/min流速为好。

2.3 柱层析纯化结果

按照静态吸附所确定的最佳吸附及解吸条件进行放大实验，按要求分别调配好φ(丙酮)=10%丙酮除杂液以及φ(丙酮)=90%洗脱液于溶剂瓶中，w(NaOH)=4%的PVPP再生液装于再生液溶剂瓶中。称取60 g PVPP于中压柱内，用柱塞式溶剂泵泵入φ(丙酮)=90%平衡层析柱，泵入1 500 mL茶多酚提取液后，经1 200 mL去水离子水水洗，2 500 mLφ(丙酮)=10%溶液除杂，再泵入5 000 mLφ(丙酮)=90%洗脱液洗脱，洗脱液分段收集，每份100 mL，用薄层层析及HPLC跟踪分析检测，合并，减压浓缩回收洗脱液。浓缩液再经乙酸乙酯萃取后，真空干燥得产品。低纯度组分收集后作为层析原料再次纯化。

经上述柱层析纯化后，可制备w(茶多酚)>98%，w(咖啡因)<1%，w(EGCG)=60.12%的产品，EGCG回收率为85.25%。

2.4 PVPP的再生

由于PVPP是一种价格昂贵的高分子精细化学品，而良好的重复使用性能则将会大大降低生产成本。为此通过对吸附-解吸后的PVPP再生处理，研究其再生性能。再生方法为将使用过的PVPP用去离子水冲洗后，用w(NaOH)=4%的溶液浸泡24 h，过滤后再用去离子水冲洗干净即可。实验表明，再生PVPP的收率达到95%以上，再生PVPP对EGCG的吸附性能在重复使用5次以上，PVPP的吸附性能无明显降低，结果见表1。由表1可见，PVPP具有较好的重复使用性能。

表1 PVPP再生性实验结果1)

1) 再生PVPP处理量为6 g。

3 结 论

以PVPP为填料，丙酮为洗脱剂，研究了连续中压柱层析对茶多酚及EGCG的分离和纯化，实验得到的主要结论如下。

(1) PVPP静态吸附研究表明，PVPP最佳用量为每克PVPP吸附EGCG0.25 g，常温吸附，吸附时间30 min；除杂剂为去离子水以及φ(丙酮)=10%丙酮溶液，最佳洗脱剂为φ(丙酮)=90%丙酮溶液。

(2) 连续中压柱层析分离最佳工艺条件为1 500 mm ×200 mm的自制不锈钢中压层析柱，流速为30 mL/min，经PVPP充分吸附后，去离子水和φ(丙酮)=10%丙酮除杂后，用φ(丙酮)=90%丙酮洗脱，洗脱液回收溶剂后，经乙酸乙酯萃取，萃取液经浓缩、真空干燥后可将w(EGCG)提高至60.12%，回收率为85.25%。w(茶多酚)>98%，w(咖啡因)<1%。

(3) 采用丙酮进行除杂及洗脱，使溶剂的回收更加方便快捷，避免了环境污染。

(4) PVPP具有较好的再生重复使用性，大大降低了生产成本。

[ 参 考 文 献 ]

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