朱碧青，郑学礼

登革热是由登革病毒（DENV）引起的一种严重的虫媒病毒性传染病，主要在热带、亚热带地区流行［1］。据报道，全球约有25亿人受到登革热感染的威胁［2］。然而目前尚无特异有效的登革疫苗和抗病毒制剂［3］。

登革病毒属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus），其基因组为单股正链RNA，长约11 kb，共编码3种结构蛋白（C、prM、E）和7种非结构蛋 白 （NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5）［4］。其中NS3蛋白是一种亲水性的多功能蛋白，分子量（Mr）约为69kDa，含618个氨基酸，具有蛋白酶、RNA解旋酶和RNA聚合酶活性，在病毒的复制和成熟过程中起作用［5］。NS3蛋白含有蛋白酶和解旋酶两个结构域，具有良好的免疫原性，可诱导机体产生B、T细胞应答［6］。已有研究表明，NS3蛋白在病人和受试者体内可诱导产生较好的免疫反应，登革病毒NS3已成为有效的抗病毒靶标［7］。本研究目的在于构建DENV非结构蛋白NS3及其结构域的重组蛋白，并对其活性作初步鉴定，为登革疫苗的研制打下实验基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株、菌株、质粒及细胞 DENV-2（新几内亚株）和大肠杆菌DH5α为本实验室保存。载体pcDNA3.1（＋）由中山大学附属肿瘤医院实验室所赠。幼仓鼠肾细胞（BHK-21）为本实验室保存。

1.2 试剂 Trizol和Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购自美国 Omega Bio-Tec公司；逆转录酶、PFU聚合酶、快速限制性内切酶、DNA Marker、pMD 18-T Vector试剂盒、实时定量PCR试剂盒等均购自大连TaKaRa公司；抗NS3兔多克隆抗体（SAB2700181）购自德国的Sigma公司；FITC标记的羊抗兔IgG和HRP标记的羊抗兔IgG均为SantaCruz公司产品；PVDF膜、Electrochemiluminescence（ECL）试剂盒均购自Bio-Rad公司。

1.3 目的基因的扩增 根据DENV-2NGC病毒株基因组序列（GenBank：NC-001474）设计引物如下：扩增非结构蛋白NS3及其结构域NS3P、NS3H的基因序列（图1）。……