王桂燕,李 锋,史济月,周启星 (.沈阳药科大学制药工程学院,辽宁 沈阳 006；.沈阳大学师范学院,辽宁 沈阳 0044；3.南开大学环境科学与工程学院,环境污染过程与基准教育部重点实验室,天津 30007)

四氯乙烯(PCE)广泛用作干洗剂和金属脱脂剂.PCE的大规模使用,以及对其不能充分回收,致使部分PCE在使用过程中释放出来,排放到空气、水或土壤中去,成为工厂车间、地表水和地下水中常见的污染物.国际肿瘤研究中心(IARC)将其列入人类可能致癌物(B2级)[1].外界污染物胁迫情况下,生物体体内会产生大量的过剩自由基,引起对生物体的氧化胁迫,导致细胞膜脂质过氧化,生物体生理代谢功能紊乱.超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)是生物体体内抗氧化防御系统的重要保护酶,它们能在一定基础上清除活性氧自由基,维持膜系统的稳定,降低氧化胁迫对细胞的伤害程度.抗氧化防御系统成分的改变可以作为机体受到氧化胁迫的早期预警生物标志物[2-3],其含量水平、活性大小可作为测定生物对外界氧化胁迫反应的生理生化指标,测定在氧化胁迫下草鱼组织内SOD和POD的活性,可以从一个侧面揭示污染物对生物的毒性机制,间接反映环境中有毒有害物质的存在.为此,以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为试验对象,研究 PCE对草鱼的肝胰脏、肾脏和鳃组织的 SOD和POD的影响,探讨以SOD和POD活性变化作为PCE污染生物指标的可能性,为抗氧化防御系统的毒理学研究提供更多的基础资料.并为水环境中该化合物污染影响的早期预报和防治提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试动物 草鱼购自沈阳北市场.选择标准:头小体阔,鳞片完整舒展,行动活泼、反应灵敏、逆水性强,外观正常,个体均匀的健康鱼,体长＜5cm,最大与最小体长之比＜1.5,体重为 (4.10±0.74)g.运回实验室放入大型水族缸中,驯养7d(期间死亡率低于 5%)后进行实验.实验用水为充分曝气的自来水.

1.1.2 供试化合物 PCE,购自天津基准化学试剂有限公司,氯化硝基四氮唑蓝(NBT),L-蛋氨酸,核黄素,磷酸氢钠,磷酸二氢钠,EDTA,无水乙醇等为市售,均为分析纯.

1.1.3 主要仪器 高速低温冷冻离心机(HITACHI CP 80MX),紫外/可见分光光度计(WFZ 800–D3B),恒温光照培养箱(MGC-350BP-2),溶解氧测定仪(HI9143).

1.2 实验步骤与方法

采用静态试验法[4-5].试验中用水为充分曝气之后的自来水,水温(17±1),pH℃值为6.5～6.8,溶解氧(DO)含量为 5.0mg/以上,硬度在210.1mg/L(以 CaCO3计)左右.试验在 25cm×18cm×25cm的小水族缸中进行.定期监测溶液的温度、pH值、DO.水族缸全天曝气.为防止饵料的影响,试验期间不喂食.

将一定量的四氯乙烯用无水乙醇(乙醇的体积分数不超过10%)溶解,然后用事先充分曝气的自来水稀释到所需实验浓度.

1.2.1 试验浓度设计 在单一急性毒性试验基础上,求得PCE污染物96h的LC50值为34.56mg/L[6],然后分别选取 1/2LC50、1/4LC50、1/8LC50和1/16LC504个浓度组,每个浓度设3个平行组,同时设1个空白对照组,每1浓度组随机放鱼10尾.

1.2.2 酶活性测定 PCE暴露试验每隔24h更换1次新鲜试验液.分别在暴露的第24、48、72、96、120、144和168h从每浓度组中和对照组中随机取出3条草鱼,迅速解剖,取肝胰脏、肾脏和鳃等组织,然后于 50mmol/L预冷磷酸盐缓冲溶液(pH7.8,含0.1mmol/L的EDTA)中匀浆,将匀浆液转移到10mL离心试管中于4℃、15000r/min条件下低温离心 30min,上清液即为酶提取液,将其低温保存.SOD活性的测定采用氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化还原法[7],1个酶活性单位(U)定义为引起3.0mL反应液达到50%抑制所需的酶量,酶活性以U/g·FW表示.POD的活性测定采用愈创木酚(邻甲氧基苯酚)法[7],定义在波长470nm处吸光度值变化0.01代表1个酶活力单位(U),酶活性以 U/(g·FW·min)表示,组织质量均以鲜质量计.

1.3 数据处理

采用SPSS13.0统计软件对试验数据进行分析,数据用平均数±标准偏差(Mean±SD)表示.并用t检验法对组间数据进行差异显著性分析,P＜0.05表示差异显著,P＜0.01表示差异极显著.

2 结果与分析

2.1 PCE对草鱼SOD活性的影响

2.1.1 PCE对草鱼肝胰脏SOD活性的影响 从表1可以看出,在PCE污染条件下,随着暴露浓度增加,24和48h内草鱼肝胰脏SOD活性变化显著(P＜0.05).与0mg/L相比,草鱼肝胰脏SOD活性在最低浓度组(2.17mg/L)时,受到显著诱导(P＜0.05),在其他浓度组时其活性又被显著抑制(P＜0.05);暴露 72h,最高浓度组(17.28mg/L)的草鱼肝胰脏SOD 活性仍然被显著抑制(P＜0.05),其他较低浓度组的草鱼肝胰脏 SOD活性均被显著诱导(P＜0.05);暴露 96h,所有浓度组的草鱼肝胰脏SOD 活性均被显著诱导(P＜0.05);当暴露时间继续增加到 120h以上时,所有浓度组草鱼肝胰脏SOD 活性被抑制,其活性显著低于对照(P＜0.05).方差分析表明,暴露浓度对草鱼肝胰脏SOD活性影响极显著(P＜0.01),暴露时间对草鱼肝胰脏SOD活性影响显著(P＜0.05),并且PCE浓度与暴露时间存在显著的交互作用(P＜0.01).

表1 PCE对草鱼肝胰脏SOD活性的影响(U/g·FW)Table 1 Effects of PCE on the SOD activity (U/g·FW) in the grass carp liver tissues

2.1.2 PCE对草鱼肾脏SOD活性的影响 从表2可以看出,在PCE污染条件下,随着暴露浓度的增加,24h内草鱼肾脏 SOD活性变化显著降低(P＜0.05);48h时草鱼肾脏在2.17和4.34mg/L时,受到显著抑制(P＜0.05),而在 8.69和 17.28mg/L时其活性又被诱导,均显著高于对照(P＜0.05);在暴露 72h时,低浓度组(2.17mg/L)草鱼肾脏被显著诱导(P＜0.05),而在 4.34mg/L以上浓度组肾脏的 SOD活性被极显著抑制(P＜0.01);在暴露 96h以上时,各个浓度组的草鱼肾脏SOD活性均被显著抑制(P＜0.05).方差分析表明,暴露浓度和暴露时间对草鱼肾脏 SOD活性影响显著(P＜0.05),并且 PCE浓度与暴露时间存在显著的交互作用(P＜0.01).

表2 PCE对草鱼肾脏SOD活性的影响(U/g·FW)Table 2 Effects of PCE on the SOD activity (U/g·FW) in the grass carp kidney tissues

2.1.3 PCE对草鱼鳃组织 SOD活性的影响 从表3可以看出,在PCE污染条件下,随着暴露浓度的增加,24h内当浓度为 2.17mg/L时,草鱼鳃组织SOD 活性变化显著降低(P＜0.05),而当浓度增加到4.29mg/L鳃组织的SOD活性又恢复到与对照组没有显著差异(P＞0.05),当浓度继续增加时,鳃组织的SOD活性又呈现显著被抑制(P＜0.05);暴露48h以上时草鱼鳃组织在污染暴露的浓度组中均呈现显著被抑制(P＜0.05).方差分析表明,暴露浓度和暴露 时间对草鱼鳃组织SOD活性影响不显著(P＞0.05).

表3 PCE对草鱼鳃组织SOD活性的影响(U/g·FW)Table 3 Effects of PCE on the SOD activity (U/g·FW) in the grass carp gill tissues

2.2 PCE对草鱼POD活性的影响

2.2.1 PCE对草鱼肝胰脏POD活性的影响 从表4可以看出,在PCE污染条件下,随着暴露浓度的增加,24h内草鱼肝胰脏 POD活性变化显著(P＜0.05).与0mg/L相比,草鱼肝胰脏POD活性在暴露的浓度范围内均受到显著抑制(P＜0.05);在暴露48h时,在2.17、4.34和8.69mg/L浓度组活性显著低于对照(P＜0.05),而在最高浓度组(17.28mg/L),其 POD 值又被诱导,显著高于对照(P＜0.05);暴露72h时,在4.34mg/L浓度组肝胰脏POD 活性被诱导,其值显著高于对照(P＜0.05);在暴露96h以上,草鱼肝胰脏的POD活性显著被抑制(P＜0.05).方差分析表明,暴露时间对草鱼肝胰脏POD活性影响极显著(P＜0.01),并且PCE浓度与暴露时间存在显著的交互作用(P＜0.01).

2.2.2 PCE对草鱼肾脏POD活性的影响 从表5可以看出,在PCE污染条件下,随着暴露浓度的增加,24h内草鱼肾脏 POD活性变化显著(P＜0.05),低浓度组(2.17mg/L)草鱼肾脏 POD 显著高于对照组(P＜0.05),而高浓度组的POD值都显著低于对照组(P＜0.05);48h时草鱼肾脏在较低浓度(2.17和4.34mg/L)组,受到显著抑制(P＜0.05),而在较高浓度(8.69和17.28mg/L)时其活性又被诱导,均显著高于对照(P＜0.05);在暴露 72h时,低浓度组(2.17mg/L)草鱼肾脏 POD活性被显著诱导(P＜0.05);在暴露120h以上时,各个浓度组的草鱼肾脏POD活性均被显著抑制(P＜0.05).方差分析表明,PCE暴露时间对草鱼肾脏POD活性影响极显著(P＜0.01),并且 PCE浓度与暴露时间存在显著的交互作用(P＜0.01).

表4 PCE对草鱼肝胰脏POD活性的影响[U/(g·FW·min)]Table 4 Effects of PCE on the POD activity [U/(g·FW·min)]in the grass carp liver tissues

2.2.3 PCE对草鱼鳃组织 POD活性的影响 从 表6可看出,随着PCE暴露浓度的增加,24h内各暴露的浓度内草鱼鳃组织 POD活性变化显著增加(P＜0.05);随着染毒时间的延长,较低浓度组鳃组织的POD活性被诱导,显著高于对照(P＜0.05),而当浓度增加到17.28mg/L时,鳃组织的POD活性又恢复到与对照无显著差异(P＞0.05);当染毒时间延长到144h以上时,各暴露的浓度组内鳃组织的POD活性又呈现显著被抑制(P＜0.05).方差分析表明,暴露时间对草鱼鳃组织POD活性影响显著(P＜0.05).

表5 PCE对草鱼肾脏POD活性的影响[U/(g·FW·min)]Table 5 Effects of PCE on the POD activity [U/(g·FW·min)]in the grass carp kidney tissues

表6 PCE对草鱼鳃组织POD活性的影响[U/(g·FW·min)]Table 6 Effects of PCE on the POD activity [U/(g·FW·min)]in the grass carp gill tissues

3 讨论

当有机体受到污染胁迫时,其体内抗氧化系统酶活性改变,发生氧化应激作用,这种氧化应激作用因有机体及污染物种类、胁迫浓度和暴露时间不同而不同[8-11].氧化应激反应是生物体的活性氧簇(ROS)和抗氧化防御系统之间不平衡的结果

[12],ROS是过渡金属离子、农药、石油污染物等物质诱导产生的[13].ROS 的逐步产生可以导致蛋白质和脂质的氧化,基因表达的改变以及细胞氧化还原状态的变化[14].抗氧化防御系统作为活性氧的去除系统, 在参与活性氧的清除以及机体的保护性防御反应中发挥巨大作用, 主要包括酶系统(SOD、POD 等)与一些小分子抗氧化物.生物体的抗氧化防御系统对污染物胁迫相当敏感,特别是SOD对多种污染物的反应均很敏感.SOD被认为是抵抗过氧化反应的保护酶之一[15],是生物体内唯一以超氧阴离子作为专一性底物的抗氧化酶.在PCE胁迫下,低浓度(2.17mg/L)的PCE胁迫较短时间(96h)内导致草鱼肝胰脏组织的 SOD活性首先升高,说明此时草鱼肝胰脏和肾脏体内积累了大量的活性氧自由基,SOD为清除这些干扰物质而被诱导.已有研究表明,生物受到轻度逆境胁迫时,SOD活性往往升高[16].如水丝蚓在Hg2+的应激条件下,当 Hg2+浓度在 8.000～9.241μL/L范围时,SOD活性显著上升[17];暴露于 0.5mg/L BaP中7d时,大弹涂鱼肝脏中SOD活性被显著诱导[18];草鱼在低浓度(0.01mg/L和 0.20mg/L)十二烷基硫酸钠暴露时,肌肉、血浆及肝脏SOD均受到不同程度的诱导[19],这些与本试验中得到的结果基本一致.另外,在 PCE胁迫下,低浓度(2.17mg/L)的PCE胁迫较短时间(96h)内也导致草鱼肾脏组织和鳃组织的POD活性也升高. POD是生物体内重要的抗氧化防御系统,可催化过氧化氢与氢供给体之间的氧化反应,从而分解有毒物质H2O2.当生物体受到轻度逆境胁迫时,POD活性往往升高,以清除体内的活性氧自由基.然而抗氧化酶清除自由基的能力毕竟有限,在长期的氧化胁迫下,氧化损伤难以避免,进而造成机体细胞病变导致疾病发生.一些研究也表明,抗氧化酶活性的变化与污染物的浓度具有相关性[20],在其耐性限度内,随着污染物浓度的增加,POD和SOD活性也增加;但超过了其耐性阈值,细胞受到严重伤害,导致其应激的能力下降,因此POD和SOD活性也就不可避免地降低,因此一般情况下,严重胁迫能够导致POD、SOD酶活下降[21-23].本研究中,发现过度胁迫时也能够导致鱼体内的SOD和POD酶活性受到显著的抑制.这一方面可能是由于草鱼出现中毒症状,致使SOD代谢外源性化合物的能力受到破坏或饱和[24],另一方面可能是由于草鱼体内抗氧化防御系统的其他成分的介入,清除了部分活性氧[25].另外可能是当重度或长时间逆境胁迫超出生物体抗氧化防御系统的防御能力时,致使POD活性降低,使生物体内积累过量的活性氧,从而伤害生物体.PCE通过与酶发生相互作用而改变其蛋白结构,从而改变其功能活性[26].在试验48h和76h时草鱼肾脏POD活性变化出现波动,其原因有待于进一步试验研究.草鱼鳃组织只有在中等浓度组(4.34mg/L)在24h内SOD酶活性与对照组没有显著变化(P＞0.05),其它浓度组在整个暴露时间内 SOD酶均受到显著抑制(P＜0.05).鳃组织的POD酶活性在24h内均显著升高,随后就降低.草鱼肝胰脏、肾脏和鳃组织中SOD活性和敏感性的不同,可能与它们的不同生理功能有关.肝脏是体内主要的解毒器官,肝巨噬细胞有活跃的吞噬能力,毒物在肝脏内氧化、还原或水解过程中会产生大量的O2-,从而使肝组织SOD活性较高.另外,草鱼在PCE暴露时,PCE由鳃进入血液作用到很多靶组织细胞,这些被伤害的组织细胞产生的代谢紊乱产物又汇集到肝脏,从而引起肝组织SOD活性的变化.肾脏是机体排泄污染物及其代谢产物的重要脏器,由于在肾内毒物代谢产物得到浓缩,因而对肾组织引起损害产生肾毒性.而鳃只是呼吸器官,既不具备解毒功能又没有排泄功能,因此鳃组织的SOD活性要比肝和肾的低得多.笔者认为,由于鱼首先通过鳃呼吸,污染物最先接触鳃组织,所以鳃组织的酶活性降低.

在试验中笔者观察到,当草鱼受PCE胁迫短时间内肝胰脏和肾脏组织中SOD和POD酶活性首先受到抑制,随着暴露时间的延长,草鱼肝胰脏和肾脏组织的SOD和POD活性又显著升高(如草鱼暴露在4.34mg/L和8.69mg/L浓度组中,其肝胰脏组织SOD酶活性在48h内首先被显著抑制,污染暴露 72h其酶活性又被显著诱导).这种现象与Beaumont等[27]的研究结果类似.Stebbing[28]认为毒物在低浓度下出现的这种现象,是其在无毒情况下的刺激反应,他把这一现象称为“毒物兴奋效应”.迄今为止,研究证明,“毒物兴奋效应”具有普遍性[29].SOD、POD酶活性升高一方面说明草鱼受到了一定的刺激; 另一方面也说明草鱼对外界刺激的反应能力很强,通过提高酶活性来保护机体免受更深的损伤.随着 PCE胁迫暴露的时间继续延长,草鱼肝胰脏和肾脏SOD和POD酶活性再次显著降低,最后出现草鱼个体死亡.可见SOD和POD酶活性的降低所造成的活性氧伤害是引起草鱼死亡的重要原因之一.

4 结论

4.1 草鱼肝胰脏和肾脏组织的SOD、POD酶活比鳃组织的高.

4.2 PCE胁迫导致草鱼肝胰脏和肾脏组织的SOD和POD活性均有显著变化. SOD、POD酶活能够反映出污染物对草鱼的毒性作用.

4.3 较低浓度的胁迫能够诱导草鱼肝胰脏和肾脏组织的SOD、POD酶活,但是过度胁迫将导致草鱼肝胰脏和肾脏组织的SOD、POD酶活的下降,进而产生毒性效应. SOD和POD酶活性的降低所造成的活性氧伤害是引起草鱼死亡的重要原因之一.

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