姜东生,李 梅,崔益斌 (南京大学环境学院,污染控制与资源化研究国家重点实验室,江苏 南京 210023)

汞、铬和铅作为8大有害重金属中毒性较强的物质,具有很强的富集性,很难在环境中降解[1],且超过一定浓度后可造成生物体的急性中毒、亚急性中毒和慢性中毒等[2].2, 4-二氯酚(2, 4-DCP)、2, 4, 6-三氯酚(2,4,6-TCP)和五氯酚(PCP)等氯酚类化合物(CPs)是应用极为广泛的一类化合物,其主要用于有机材料的氯化处理,杀虫剂、阻燃剂和木材防腐剂等[3],具有毒性高,持久性强,难降解并可通过食物链累积等特点[4-5],被列为我国水体中优先控制污染物[6].

目前,许多学者[7-14]对全国重要河流监测后发现,重金属和氯酚类物质在我国水体中普遍存在,其中个别样点的浓度已经达到了较高值.然而,我国至今未出台有关上述污染物质对水生生物评估标准或准则,其评估仍不得不采用水环境质量标准体系[15].试验用霍甫水丝蚓(Limnodrilushoffmeisteri)隶属于环节动物门(Arthropoda)、水丝蚓属(Limnodrilus),广泛存在于河流、湖泊,对环境适应能力较强,是淡水水生食物链的重要一环,也是鱼虾的天然饵料[16].国内学者对霍甫水丝蚓的研究主要集中在其时空分布及其扰动对沉积物中细菌群落和营养盐的影响[17-19],将其用于毒性测试的研究较少.本研究采用急性毒性试验方法,研究上述6种污染物质对霍甫水丝蚓的急性毒性,旨在达到补充上述重金属和氯酚类物质对霍甫水丝蚓的毒性数据,制定相关安全阈值、开展水生态风险评估以及突发事件处理提供参考的目的.

1 材料与方法

1.1 受试生物与实验药剂

霍甫水丝蚓购自济南水族市场,在 15～25℃条件下,培养于(60×25×20)cm3的流水式鱼缸中,鱼缸底部铺5cm左右底泥,加入一定量的曝气水.实验前挑选 2.0～3.0cm 健康活泼幼体,放入装有曝气水的直径90mm高45mm的结晶皿中,盖上表面皿,在22℃、自然光照的人工气候培养箱中清肠 24h,清肠后仍然健康的霍甫水丝蚓作为正式实验动物.

氯化汞(HgCl2)、重铬酸钾(K2Cr2O7)、硝酸铅(Pb(NO3)2)和二甲基亚砜(DMSO)购自南京化学试剂有限公司,2,4-DCP、2,4,6-TCP和PCP购自百灵威科技有限公司,均为分析纯.

1.2 实验用水

参照GB/T 13266-91《水质 物质对蚤类(大型蚤)急性毒性测定方法》[20]配制人工稀释水为实验用水.新配制的标准稀释水pH 7.8±0.2,硬度(250±25)mg/L(以 CaCO3计),溶解氧浓度在空气饱和值的80%以上,并不含对大型蚤有毒的物质.用于配制人工稀释水的试剂为去离子水.

1.3 实验方法

参照文献[21]设计霍甫水丝蚓的急性毒性实验.首先将挑选的霍甫水丝蚓放入曝气自来水中清洗干净,然后随机放入盛有100mL试液直径90mm高45mm的结晶皿中,每皿20条,同时用表面皿盖好.Hg2+、Cr6+和 Pb2+采用静态实验,2,4-DCP、2,4,6-TCP和PCP采用半静态实验,每24h更换试液,实验期间不喂食,持续96h.每天观察霍甫水丝蚓中毒症状和死亡情况,并将死亡个体及时取出.霍甫水丝蚓的死亡标准为:身体泛白,失去伸缩能力,用解剖针碰触,无反应[16].

预实验以 5为公比做间隔设置浓度,以求出24h全死亡浓度和 96h无死亡浓度.正式实验以几何级数做间距,选择6个浓度(Hg2+、Cr6+和Pb2+对应浓度组分别为67.6, 87.9, 114.2, 148.5, 193.1,251.0µg/L,2, 2.76, 3.81, 5.26, 7.25, 10mg/L 和50,62.5, 78.13, 97.66, 122.07, 152.59mg/L;2,4-DCP、2,4,6-TCP和 PCP对应浓度组分别为 17.36,20.83, 25, 30, 36, 43.2mg/L,4, 5, 6.25, 7.81, 9.77,12.21mg/L和 1.73, 2.07, 2.49, 2.99, 3.58,4.3mg/L),在 3个依次的几何系列浓度中测得20%～80%的死亡率以估算 LC50值.每个实验组设置3个平行,并设空白对照.

1.4 数据处理

实验数据的统计处理参照 GB/T 13267-1991[22],使用概率单位图解法计算 LC50.具体过程为:根据死亡概率和浓度对数作图,求出线性回归方程,得到24, 48, 72, 96h-LC50,并根据公式(1)计算LC50的95%置信限:

式中:x为LC50的对数;S为对应LC50线性回归方程斜率的倒数;N为供试动物总数(但死亡率为 0和100%的组不计在内).

安全浓度(SC)和最大容许浓度(MPC)评价采用下列公式求得:

2 结果与分析

2.1 3种重金属对霍甫水丝蚓的急性毒性

3种重金属对霍甫水丝蚓急性毒性实验过程中,空白对照组霍甫水丝蚓未出现死亡,通过 3种重金属对霍甫水丝蚓的毒性实验数据分析,得出各时间段浓度对数与概率单位的回归方程以及LC50的95%置信区间(表1).由表1可见,随着实验时间的延长和实验物质量浓度的提高,毒性均明显增强,死亡率也呈明显上升趋势.其中在96h时,Hg2+、Cr6+和 Pb2+对霍甫水丝蚓的 LC50分别为0.16, 4.25, 76.24mg/L.目前,我国还没有专门针对颤蚓类的化学物质毒性分级标准,但根据国家环境保护总局《新化学物质危害评估导则》(HJ/T 154-2004)[25]中对鱼类毒性分级标准,3种重金属对霍甫水丝蚓有不同的毒性作用,其中Hg2+对霍甫水丝蚓表现为极高毒性,Cr6+对其表现为高等毒性,而Pb2+则表现为中等毒性.

表1 Hg2+、Cr6+和Pb2+对霍甫水丝蚓LC50及毒性回归方程Table 1 LC50and regression function of Hg2+,Cr6+ and Pb2+ on L. hoffmeisteri

2.2 3种氯酚类物质对霍甫水丝蚓的急性毒性

至全部实验结束,空白对照组和助溶剂(DMSO)对照组中均未出现霍甫水丝蚓行为异常或死亡情况.3种氯酚类物质染毒初期,霍甫水丝蚓均出现兴奋和剧烈扭动的中毒症状,随着污染浓度增加和时间的延长,最终会导致霍甫水丝蚓中毒死亡.3种氯酚类物质对霍甫水丝蚓的半数致死浓度 LC50及毒性回归方程见表 2.根据表2可知3种氯酚类物质对霍甫水丝蚓存在剂量-效应关系,其中在 96h时,2,4-DCP、2,4,6-TCP和PCP对霍甫水丝蚓的LC50分别为20.73, 7.86, 2.42mg/L.根据国家环境保护总局《新化学物质危害评估导则》(HJ/T 154-2004)[25]中对鱼类毒性分级标准,2,4-DCP对霍甫水丝蚓表现为中等毒性,2,4,6-TCP和PCP对其均表现为高等毒性.

表2 2,4-DCP、2,4,6-TCP和PCP对霍甫水丝蚓的LC50及毒性回归方程Table 2 LC50and regression function of 2,4-DCP, 2,4,6-TCP and PCP on L. hoffmeisteri

3 讨论

3.1 3种重金属毒性比较

本研究中Hg2+、Cr6+和Pb2+对霍甫水丝蚓的96h-LC50分别为0.16, 4.25, 76.24mg/L,毒性大小顺序为:Hg2+＞Cr6+＞Pb2+.许永香等[26]研究发现Hg2+对大型蚤(Daphnia magna)的 96h-LC50为1.40µg/L,宋维彦等[27]研究发现 Hg2+对麦穗鱼(Pseudorasbora)和中华鳑鲏鱼(Rhodens sinensis)的 96h-LC50分别为 0.244和 0.193mg/L,温茹淑等

[28]研究结果表明 Hg2+对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)96h-LC50为0.36mg/L,通过比较发现大型蚤对Hg2+最为敏感,霍甫水丝蚓次之,鱼类对Hg2+敏感性较差,研究结果与张瑞卿等[29]利用物种敏感度分布曲线法得出的 Hg2+对水生生物物种的敏感性顺序(甲壳类＞甲壳类除外的无脊椎动物类＞鱼类)一致;目前,我国 Cr6+和 Pb2+对水生生物毒性效应研究较多[30-35],杜东阳[36]在推导我国重金属铬的淡水水质基准研究中,通过计算得到 Cr6+对颤蚓属的平均急性毒性值为1.88mg/L,与本研究得到的Cr6+对霍甫水丝蚓(L. hoffmeisteri)急性毒性值相当,杨丽华[33]、梁峰[34]、吕敢堂[35]等分别研究了 Cr6+对鲫鱼(Carassius cuvieri)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)仔鱼和黑鲷(Sparus macrocephalus)幼鱼的急性毒性效应,其 96h-LC50分别为 221.25,15.79, 23.01mg/L,均大于本研究结果,与杜东阳[36]计算得到的 Cr6+对水生生物毒性顺序一致.本研究结果(76.24mg/L)与付荣恕[37]等研究 Pb2+对霍甫水丝蚓的毒性效应值(4.73mg/L)相差较大,但与闫振广等[38]研究铅水生生物水质基准值时计算得到的颤蚓属平均急性值(14.62mg/L)相当,且均小于Pb2+对鲫属、泥鳅属和草鱼属的属平均毒性值,可以发现霍甫水丝蚓较我国常见鱼类对Pb2+更为敏感.通过张瑞卿[29]、杜东阳[36]和闫振广[38]对3种重金属淡水水质基准研究发现,Hg2+、Cr6+和 Pb2+对颤蚓属的平均毒性值分别为2.14µg/L、1.88mg/L 和 14.62mg/L,毒性顺序依次为:Hg2+＞Cr6+＞Pb2+,与本研究结果一致.

3.2 3种氯酚类物质毒性比较

由表 2试验结果可知,3种氯酚类物质对霍甫水丝蚓均产生了毒性作用,且毒性大小顺序依次为:PCP＞2,4,6-TCP＞2,4-DCP.罗茜等[39]推导2,4-DCP水生态毒理和水质基准过程中发现2,4-DCP的急性毒性范围为 1000～100000µg/L.但 Yin等[40]在推导我国淡水水生生物 2,4-DCP水质基准时,测定了大型蚤(D. magna)、摇蚊幼虫(Chironomus tentans)、草鱼(C.idellus)等 9 种我国优势水生物种的急性毒性,发现其96h和48h的LC50值的范围为 1790～11700µg/L,表明 2,4-DCP对霍甫水丝蚓敏感性较差.Yin等[41]在推导2,4,6-TCP水质基准过程中测得9种我国优势物种 96h和 48h的 LC50的范围为1460～9290µg/L,其毒性范围包括本研究中 2,4,6-TCP对霍甫水丝蚓的96h-LC50值(7.86mg/L).我国对PCP毒性效应研究较多,其中闫宾萍[42]、聂晶磊[43]等分别研究了PCP对羽摇蚊幼虫(Chironomus plumosus)和金鱼(Carassias auratus)的毒性效应,研究发现PCP对两种水生生物的 48h-LC50分别为 0.09,0.21mg/L,研究结果均小于本研究中PCP对霍甫水丝蚓的急性毒性效应值,同为底栖水生生物的摇蚊幼虫可能较受试霍甫水丝蚓对PCP更为敏感.另外,张亚辉[44]、金小伟[45]等通过研究3种氯酚类化合物对大型溞(D. magna)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)和细鳞斜颌鲴(Plagiogna microlepis)的急性毒性效应,发现3种氯酚类物质的急性毒性大小顺序均为:PCP＞2,4,6-TCP＞2,4-DCP,与本研究结果一致.Leblanc等[46]报道氯酚化合物中高取代氯酚对水生生物的毒性比低取代氯酚大,但也有研究[47]表明氯酚类污染对水生生物的毒性与氯酚苯环上的氯原子取代数目无直接关系,只有一氯代酚的毒性明显低于其他多氯代酚的毒性.

3.3 6种污染物环境安全性评价

在有关化学品对生物毒性安全性评价中,我国还没有统一的评价标准.本实验根据急性毒性基础数据,推导出上述 6种污染物对霍甫水丝蚓的安全浓度和最大容许浓度.安全浓度指在污染物的持续作用下,生物可以正常存活、生长、繁殖的最高毒物浓度.最大容许浓度指对受试生物不产生毒性危害的毒物最大允许浓度.目前化学品安全浓度的计算方法经常采用常规方法,即公式(2)、公式(3)中提到的方法.

根据霍甫水丝蚓半数致死浓度96h-LC50可以得到6种污染物质的SC和MPC见表3,由表3可知,Hg2+、Cr6+和 Pb2+的安全浓度和最大允许浓度分别为16, 425, 7624µg/L和1.6, 42.5, 762.4µg/L;2,4-DCP、2,4,6-TCP、PCP的安全浓度和最大允许浓度分别为 2073, 786, 242µg/L和 207.3, 78.6,24.2µg/L.通过与美国EPA基准值及中国地表水水环境质量标准比较发现,Pb2+和2,4-DCP的最大允许浓度大于其对应的基准和标准值,实验所得到的2,4,6-TCP最大允许浓度低于我国地表水环境质量标准,Hg2+、Cr6+和PCP与美国和中国规定限值基本吻合.虽然本研究预测的部分污染物最大允许浓度与规定的标准限值相差不大,但上述污染物在实际水体中水质标准的制定还需要更多水生生物毒理学基础实验数据.同时,上述污染物水质标准的制定还要考虑各种其他因素的影响,如水体用途,水质特征及经济、社会因素等.

表3 6种污染物安全性评价与基准、标准值比较(µg/L)Table 3 Safety assessment of six pollutants compared with their aquatic criteria and standards (µg/L)

3.4 我国主要河流6种物质污染现状及与水质基准比较

目前关于我国主要河流流域重金属和氯酚类物质的研究较多[7-14](表 4),由于重金属主要赋存在悬浮物和沉积物中[48],且悬浮颗粒物中重金属的含量比沉积物中高几倍,是水体溶解态重金属的几百倍[49],因此大多学者研究结果为我国主要河流沉积物中重金属含量.

由表4可知,珠江部分水域沉积物中Hg含量较高,辽河和长江下游铜陵矿区河流沉积物中Cr含量高于其他流域,长江铜陵矿区和海河流域Pb含量较高.Gao等[14]研究了我国主要河流3种氯酚类物质的含量,研究发现辽河、海河、黄河和淮河 3种氯酚类物质检出率较高,其中黄河流域水体中,3种氯酚含量均高于其他河流.对照于表3中上述污染物的慢性水质基准值和我国地表水水质标准值,我国部分水体呈现一定的生态风险,值得关注.

表4 我国主要河流水体中6种污染物质含量分布Table 4 Concentrations of 6pollutants in the water of the main rivers in China

4 结论

4.1 6种污染物质对霍甫水丝蚓都产生了很大的毒性效应,存在一定的剂量-效应关系,且随着暴露时间延长,毒性作用增加.参考化学物质对鱼类的毒性分级标准,Hg2+对霍甫水丝蚓的毒性属于极高毒性,Cr6+、2,4,6-TCP和PCP对霍甫水丝蚓的毒性属于高等毒性,Pb2+和 2,4-DCP则对霍甫水丝蚓产生的毒性效应为中等毒性.

4.2 3种重金属对霍甫水丝蚓的毒性作用大小顺序为:Hg2+＞Cr6+＞Pb2+;3种氯酚类物质对霍甫水丝蚓的毒性大小依次为:PCP＞2,4,6-TCP ＞2,4-DCP .

4.3 根据6种污染物对霍甫水丝蚓的急性毒性实验,水体中Hg2+、Cr6+和Pb2+的安全浓度SC分别为16, 425, 7624µg/L,最大允许浓度MPC分别为 1.6, 42.5, 762.4µg/L;2,4-DCP、2,4,6-TCP 和PCP的安全浓度SC分别为2073, 786, 242µg/L,最大允许浓度MPC分别为207.3, 78.6, 24.2µg/L.4.4 我国主要河流沉积物中存在一定程度的重金属污染,氯酚类物质检出率较高,其中黄河流域氯酚类物质的污染最为严重,存在一定的生态风险.

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