李建立，高冬艳，杜彦茹，侯艳宁

（1.河北省人民医院麻醉科，河北石家庄 050051；2.白求恩国际和平医院药剂科，河北 石家庄 050082）

Ikononmidou等［1］发现，出生 14 d内的新生大鼠使用NMDAR拮抗剂（MK-801）后能引起神经细胞凋亡样损伤，成年大鼠却没有出现此现象，说明在大鼠脑发育高峰期（出生前1 d至出生后14 d）使用NMDAR拮抗剂会干扰中枢神经系统发育。氯胺酮作为一种NMDAR拮抗剂，最近大量动物实验表明，在中枢神经系统的快速发育期反复应用氯胺酮可以影响神经系统的发育，导致神经元凋亡增加，甚至影响成年后的学习记忆功能［2-3］。另外多项体外实验表明氯胺酮可导致原代培养的皮层神经元凋亡［4-5］。氯胺酮广泛应用于小儿麻醉，其神经毒性令人担忧，因此寻找有效的措施防范氯胺酮的发育期神经毒性变得尤为迫切。内源性神经甾体是一类由脑组织经胆固醇在各种酶的作用下合成的甾类化合物，被称为第四类神经递质，具有广泛的生物学效应，不仅参与生长、发育、成熟及衰老过程，也参与对焦虑、抑郁、睡眠、情绪反应及学习记忆等认知功能的调节［6］。雌二醇作为一种内源性神经活性甾体，近年来大量研究表明对多种神经损伤具有保护作用，日益受到重视［7］。然而17β雌二醇是否保护皮层神经元免受氯胺酮导致的凋亡尚不清楚，因此本文就此进行了研究。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂 氯胺酮（福建古田药业有限公司，批号 H35020148）；DMEM培养液、胎牛血清、Neurobasal培养液、B27促生长剂购自美国Gibco公司；LY294002、17β雌二醇、DMSO、MTT购自美国Sigma公司；TUNEL试剂盒购自德国Mannheim公司；胰蛋白酶购自北京索来宝公司；Akt和pAkt抗体购自美国Cell Signal Technology公司。

1.2 皮层神经元原代培养 参照文献方法［8］，略加改进。取新生24 h内的SD幼鼠，无菌操作下迅速取出大脑，用D-Hanks液清洗后取出大脑皮质，剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，经0.125%胰蛋白酶37℃消化15 min，用含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，然后把细胞转移到含10%胎牛血清的DMEM培养基中制成细胞悬液。然后经100目钢丝筛过滤，计数后按1×109·L-1的密度接种于经多聚赖氨酸处理的培养板，37℃、5%CO2培养箱内培养24 h后，全量换neurobasal+B27培养基，以后每隔2天半量换液1次。体外培养7 d的神经元用于以下实验。

1.3 实验分组 观察氯胺酮对神经元存活率影响时，氯胺酮终浓度分别为0、1、10、100、1 000μmol·L-1。观察17β雌二醇对神经元保护作用时，分为对照组、氯胺酮组（氯胺酮终浓度为100μmol·L-1）、氯胺酮+17β雌二醇组（氯胺酮终浓度为100 μmol·L-1，17β雌二醇终浓度分别为 0.001、0.01、0.1、1μmol·L-1）。检测各种处理对神经元形态、神经元凋亡和pAkt蛋白表达的影响时，分为对照组、氯胺酮组（终浓度为100μmol·L-1）、氯胺酮+17β雌二醇组（氯胺酮100μmol·L-1，17β雌二醇0.1μmol·L-1），氯胺酮 +17β雌二醇 +LY294002组（氯胺酮100μmol·L-1，17β雌二醇 0.1μmol·L-1，LY294002 10μmol·L-1）。

1.4 MTT法检测神经元存活率 将细胞接种于96孔板，体外培养至d 7分别加入不同的药物处理24 h，翻板法弃去培养液，每孔加入10μl MTT液，37℃孵育4 h，弃上清，加入200μl DMSO，轻轻振荡溶解甲臜结晶，在多功能酶标仪上测定570 nm的吸光度值。以对照组平均吸收值为100%，以各处理组吸收值与对照组的比值计算存活率。

1.5 神经元凋亡的检测 应用TUNEL法检测凋亡神经元。将细胞涂片用4%多聚甲醛室温下固定30 min，然后PBS洗3次，0.3%H2O2封闭内源性过氧化酶30 min，然后在0.1%Triton X-100的0.1%柠檬酸钠溶液中4℃孵育5 min，将50μl TUNEL反应液在37℃湿盒中反应60 min，PBS冲洗3次，然后再加入50μl可转变还氧化酶反应液，37℃湿盒中孵育30 min，最后加入50μl底物反应液室温反应10 min。光镜下观察神经元，细胞核有棕黄色颗粒者为阳性神经元，采取5个不同的视野，计算阳性和阴性细胞数量。

1.6 Western blot法测定p Akt蛋白表达 细胞经各种处理后，收集细胞，裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，BCA法检测样品蛋白含量。取待测蛋白质50μg加上样缓冲液煮沸变性，于10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中100V电泳1.5 h，转膜2 h，加入 Akt、pAkt抗体（1∶2 000），4℃过夜，常规洗涤，加羊抗鼠二抗（1∶5 000），37℃孵育60 min，洗涤，电化学法发光，显影，扫描，用凝胶图像处理系统分析目标条带与内参照条带吸光度的比值。实验重复3次，设Akt蛋白为内参。

1.7 统计学分析 所有数据采用¯x±s表示，应用SPSS13.0软件进行处理，采用单因素方差分析（ANOVA）和SNK检验进行数据分析。

2 结果

2.1 各种处理神经元存活率变化 神经元经过1、10、100、1 000μmol·L-1的氯胺酮处理 24 h后，存活率分别为（98.03±5.55）%、（79.34±5.01）%、（58.17±2.84）%、（31.41±1.84）%，其中10、100、1 000μmol·L-1氯胺酮处理后神经元存活率明显低于对照组（P＜0.01），见 Fig 1。100μmol·L-1氯胺酮处理神经元的同时分别加入0.001、0.01、0.1、1μmol·L-1的17β雌二醇共同处理24 h后，其存活率分别为（54.78±5.05）%、（75.1±9.25）%、（88.33±8.54）%、（79.54±10.25）%，其中0.1μmol·L-117β雌二醇保护效果最好，见Fig 2。

Fig 2 Effect of 17β-estradiol treatment on neuron viability±s，n＝6）**P＜0.01 vs control；##P＜0.01 vs ketamine

2.2 各种处理对神经元形态的影响 对照组神经元胞体丰满，突起较长，相互之间神经网络连接紧密。100μmol·L-1氯胺酮处理24 h后，神经元胞体立体感消失，颜色变暗，细胞轮廓不清，神经元轴突断裂，部分死亡。0.1μmol·L-117β雌二醇与100μmol·L-1氯胺酮共处理部分逆转了氯胺酮引起的神经元细胞形态变化。而 10μmol·L-1LY294002拮抗了17β雌二醇对神经元的保护作用，见Fig 3。

2.3 各种处理对神经元凋亡的影响 100μmol·

L-1氯胺酮处理神经元24 h后，TUNEL阳性神经元较对照组明显增加，而加入0.1μmol·L-117β雌二醇共同处理24 h，TUNEL阳性神经元较氯胺酮组明显减少，而 10μmol·L-1LY294002预处理组TUNEL阳性神经元较17β雌二醇+氯胺酮组明显增加，见Fig 4。

Fig 3 Effect of different treatments on structure of neuronsa：Control；b：Ketamine；c：17β-estradiol+ketamine；d：17β-estradiol+ketamine+LY294002

Fig 4 Effect of 17β-estradiol treatment on neuronal apoptosis induced by ketamine exposure（±s，n＝6）**P＜0.01 vs control；##P＜0.01 vs ketamine；ΔΔP＜0.01 vs ketamine+17β-estradiol.a：Control；b：Ketamine；c：17β-estradiol+ketamine；d：17β-estradiol+ketamine+LY294002

2.4 各种处理对pAkt蛋白表达的影响 100μmol·L-1氯胺酮处理神经元2 h后，pAkt蛋白表达降低，明显低于对照组（P＜0.01）。氯胺酮与17β雌二醇共处理2 h后，pAkt蛋白表达较氯胺酮单纯处理组明显增加（P＜0.01）。加入LY294002后pAkt蛋白表达降低，明显低于氯胺酮+17β雌二醇组（P＜0.01），见 Fig 5。

Fig 5 Effect of different treatments on p Akt level（±s，n＝6）**P＜0.01 vs control；##P＜0.01 vs ketamine；ΔΔP＜0.01 vs ketamine+17β-estradiol.

3 讨论

人类大脑的快速发育期为怀孕后3个月到出生后3年，全世界每年都有数百万婴幼儿在此时间内由于各类外科手术或诊断需要等原因接受全身麻醉。氯胺酮是婴幼儿麻醉最为常用的麻醉剂，最近研究表明，发育期大脑应用氯胺酮可引起神经元的大量凋亡［2-5］。因此氯胺酮的临床应用，尤其是在婴幼儿中的应用，引起了广泛的关注。针对麻醉药引起的发育期大脑损伤，NIH、FDA以及IARS要求研究者不仅要研究其发生机制，而且要寻找有效的措施来防治麻醉药所引起发育期神经损伤。

本研究发现氯胺酮对原代培养的皮层神经元产生剂量依赖性损伤，氯胺酮引起的神经元损伤机制目前仍不清楚。据推测，持续暴露于氯胺酮可以引起神经元NMDA受体亚单位，尤其是NR1亚单位的上调，进而导致神经元的调亡，而给予NR1反义寡核苷酸可以抑制NR1蛋白的合成，进而减轻氯胺酮引起的神经元调亡［9］。

近年来，对如何防治氯胺酮引起的发育期大脑损伤进行了一系列研究，研究表明维生素D、锂、促红细胞生成素、肉毒碱、烟酰胺、可乐定等对氯胺酮引起的发育期神经损伤产生保护作用［4，10-14］。雌二醇作为一种内源性神经活性甾体，有研究表明，17β雌二醇可以促进神经元的存活以及功能维护［15-16］。另有研究表明 17β雌二醇可以对NMDAR拮抗剂MK801所引起的发育期大脑调亡样损伤产生保护作用［17］。另外 Lu等［18］研究发现，雌二醇可对咪达唑仑、笑气、异氟醚联合应用所引起的发育期大鼠大脑广泛凋亡样损伤产生保护作用。然而17β雌二醇是否对氯胺酮所导致皮层神经元凋亡产生保护作用以及机制目前还不清楚，本文对此进行了研究。本研究发现17β雌二醇可对氯胺酮导致的皮层神经元损伤产生保护作用，激活PI3KAkt信号通路可能是其发挥保护作用的机制之一。

PI3K-Akt信号通路是近年来发现的一条参与细胞增殖调控的重要信号通路。PI3K通过催化底物Akt磷酸化而将活化信号转移到细胞内部。Akt是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，被激活的Akt在Ser-473和Thr-308位点发生磷酸化，进而产生广泛的生物学效应，如抗细胞凋亡和促进细胞存活等。同时NMDA受体在神经系统的发育、突触形成等方面具有重要的作用，还具有促进神经元存活的作用，这一作用是通过PI3K-Akt信号通路实现的［19］。本研究发现，作为NMDAR拮抗剂氯胺酮通过降低神经元pAkt蛋白的表达，进而导致神经元凋亡，这与以往的研究结果一致［5，12］。另外研究表明PI3K-Akt信号通路是雌二醇发挥神经保护作用的重要通路［17-18］。因此我们假设17β雌二醇保护皮层神经元免受氯胺酮导致的凋亡是通过激活PI3K-Akt信号通路实现的。本研究通过Western blot检测各种处理对皮层神经元pAkt蛋白表达的影响，发现氯胺酮与17β雌二醇共同作用使神经元pAkt蛋白表达增加。为了进一步证实PI3K-Akt信号通路在17β雌二醇对抗氯胺酮神经毒性中的作用，我们应用了PI3K抑制剂LY294002，观察其对神经元pAkt蛋白表达以及神经元凋亡的影响，结果表明LY294002抑制了17β雌二醇诱导pAkt表达的上调作用，同时抑制了17β雌二醇的神经保护作用，使神经元凋亡增加。

总之，氯胺酮导致了原代培养皮层神经元凋亡，这一作用是通过阻断NMDA受体，下调pAkt蛋白表达而实现的。17β雌二醇具有保护神经元免受氯胺酮损伤的作用，其机制可能是通过激活PI3K-Akt信号通路实现的。本研究为围手术期应用17β雌二醇预防氯胺酮对婴幼儿大脑产生神经损伤提供了初步的实验依据。

参考文献：

［1］ Ikonomidou C，Bosch F，Miksa M，et al.Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain［J］.Science，1999，283（5398）：70-4.

［2］ Huang L，Liu Y，Jin W，et al.Ketamine potentiates hippocampal neurodegeneration and persistent learning and memory impairment through the PKCgamma-ERK signaling pathway in the developing brain［J］.Brain Res，2012，1476（2）：164-71.

［3］ Brambrink A M，Evers A S，Avidan M S，et al.Ketamine-induced neuroapoptosis in the fetal and neonatal rhesus macaque brain［J］.Anesthesiology，2012，116（2）：372-84.

［4］ Liu F，Patterson T A，Sadovova N，et al.Ketamine-induced neuronal damage and altered N-methyl-D-aspartate receptor function in rat primary forebrain culture［J］.Toxicol Sci，2013，131（2）：548-57.

［5］ Takadera T，Ishida A，Ohyashiki T.Ketamine-induced apoptosis in cultured rat cortical neurons［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2006，210（1-2）：100-7.

［6］ Kawato S，Yamada M，Kimoto T.Brain neurosteroids are4th generation neuromessengers in the brain：cell biophysical analysis of steroid signal transduction［J］.Adv Biophy，2001，37（1）：1-48.

［7］ Melcangi R C，Panzica G，Garcia-Segura L M.Neuroactive steroids：focus on human brain［J］.Neuroscience，2011，191：1-5.

［8］ 于 洋，薛 改，吴红海，等.Aβ25-35对大鼠大脑皮层皮质神经元神经甾水平的影响［J］.中国药理学通报，2010，26（6）：783-6.

［8］ Yu Y，Xue G，Wu H H，et al.Effect of Aβ25-35on neurosteroidogenesis in primary rat cortical neurons［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26（6）：783-6

［9］ Wang C，Sadovova N，Fu X，et al.The role of the N-methyl-D-aspartate receptor in ketamine-induced apoptosis in rat forebrain culture［J］.Neuroscience，2005，132（4）：967-77.

［10］Turner C P，Gutierrez S，Liu C，et al.Strategies to defeat ketamineinduced neonatal brain injury［J］.Neuroscience，2012，210（17）：384-92.

［11］Straiko M M，Young C，Cattano D，et al.Lithium protects against anesthesia-induced developmental neuroapoptosis［J］.Anesthesiology，2009，110（4）：862-8.

［12］Shang Y，Wu Y，Yao S，et al.Protective effect of erythropoietin against ketamine-induced apoptosis in cultured rat cortical neurons：involvement of PI3K／Akt and GSK-3 beta pathway［J］.Apoptosis，2007，12（12）：2187-95.

［13］Ullah N，Ullah I，Lee H Y，et al.Protective function of nicotinamide against ketamine-induced apoptotic neurodegeneration in the infant rat brain［J］.Mol Neurosci，2012，47（1）：67-75.

［14］Ponten E，Viberg H，Gordh T，et al.Clonidine abolishes the adverse effects on apoptosis and behaviour after neonatal ketamine exposure in mice［J］.Acta Anaesthesiol Scand，2012，56（8）：1058-65.

［15］Nilsen J，Chen S，Irwin R W，et al.Estrogen protects neuronal cells from amyloid beta-induced apoptosis via regulation of mitochondrial proteins and function［J］.BMCNeurosci，2006，7（3）：74-85.

［16］Chen S，Nilsen J，Brinton R D.Dose and temporal pattern of estrogen exposure determines neuroprotective outcome in hippocampal neurons：therapeutic implications［J］.Endocrinology，2006，147（11）：5303-13.

［17］Asimiadou S，Bittigau P，Felderhoff-Mueser U，et al.Protection with estradiol in developmental models of apoptotic neurodegeneration［J］.Ann Neurol，2005，58（2）：266-76.

［18］Lu LX，Yon J H，Carter L B，et al.General anesthesia activates BDNF-dependent neuroapoptosis in the developing rat brain［J］.Apoptosis，2006，11（9）：1603-15.

［19］Sutton G，Chandler L J.Activity-dependent NMDA receptor-mediated activation of protein kinase B／Akt in cortical neuronal cultures［J］.Neurochem，2002，82（5）：1097-105.