张 梅，袁 霞，徐 波，冉福香，吴 军，葛泽梅，李润涛，崔景荣

（北京大学药学院1.天然药物及仿生药物国家重点实验室、2.化学生物学系，北京 100191；3.新疆石河子大学药学院药理系，新疆石河子 832000）

PS341（硼替佐米，万珂）于2003年被美国FDA批准用于多发性骨髓瘤和淋巴瘤的治疗［1］，该蛋白酶体抑制剂通过抑制蛋白酶体中的 CT-L（β5／β5i）、PGPH（β1／β1i）和 T-L（β2i）位点［2］引起细胞周期阻滞和细胞凋亡而产生抗肿瘤作用［3］，但同时也引起神经疾病等不良反应和耐药性［4］。基于PS341结构的启发，李润涛教授课题组合成了一系列新的三肽硼酸类化合物，经过体内外药效学筛选发现 YSY01A［N-（2-Pyrazinecarbonyl）-L-leucine-L-（2-naphthyl）-alanine-L-leucine boronic acid］（Fig 1）具有很强的杀伤肿瘤细胞及抗乳腺癌的作用。本文研究了YSY01A对乳腺癌增殖的影响，并以MCF-7细胞株为研究对象，探讨了YSY01A的抗癌机制和蛋白酶体靶向作用。

Fig 1 Structure of YSY01A

1 材料与方法

1.1 材料 YSY01A和PS341由北京大学药学院合成，纯度均在99%以上。溶于DMSO中，配制成1×10－2mol·L－1浓度，－20℃冻存。Suc-LLVYAMC、Boc-LRR-AMC、Z-LLE-AMC、Z-RR-AMC和Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VS均为 Boston Biochem公司。多克隆抗 体 ubiquitin、NF-κB，IκBα，XIAP、Bax、puma、endonuclease G和单克隆抗体 PARP、BclxL、GAPDH为 CST公司。Phospho-IκBα（P-IκBα）为Santa Cruz公司。野生型p53（wt-p53）为Bioss公司。Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒、JC-1线粒体膜电位检测试剂盒购自碧云天生物研究所。

1.2 细胞培养 人乳腺癌细胞 MCF-7、Bcap37、MDA-MB-435S细胞株购自中科院上海生命科学院细胞资源中心。MCF-7和MDA-MB-435S用含10%的血清和1%的双抗 DMEM培养液在37℃、5%CO2的培养箱中培养，而 Bcap37细胞则用 RPMI 1640培养液。

1．3 26S蛋白酶体提取 收集MCF-7细胞，PBS洗涤2次，用裂解液（50 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.5，1 mmol·L－1DTT，5 mmol·L－1MgCl2，250 mmol·L－1蔗糖，2 mmol·L－1ATP）冰上裂解细胞30 min，低温（4℃）10 000 r·min－1离心 15 min后，将上清4℃，15 000 r·min－1离心 1 h，去沉淀，用 Bradford法测定蛋白含量。

1．4 26S蛋白酶体的活性检测 蛋白酶体活性常用荧光底物法检测。Suc-LLVY-AMC、Boc-LRRAMC、Z-LLE-AMC分别为CT-L、T-L、PGPH的特异性荧光底物。体外活性检测时，从MCF-7细胞内提取26S蛋白酶体，不同浓度的YSY01A（或PS341）、26S蛋白酶体（12.5μg）和 50μmol·L－1的特异性荧光底物在缓冲液（50 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.5，5 mmol·L－1MgCl2，0.5 mmol·L－1ATP，1 mmol·L－1DTT，0.5 g·L－1BSA）中 37℃孵育 1 h。用多功能酶标仪检测 （λex＝390 nm，λem ＝440 nm）。检测体内活性时，用 37.5 nmol·L－1的YSY01A处理细胞1、2、4 h后，提取26S蛋白酶体。按照上述检测蛋白酶活性的方法检测荧光强度。

1.5 蛋白酶体活性谱分析 按照文献［5－6］报道检测细胞内蛋白酶体活性谱。25 nmol·L－1的YSY01A作用于 MCF-7细胞1、2、4、8、12、24 h。PBS洗涤细胞2次，收集细胞后，按照“1.3”提取细胞内26S蛋白酶体并定量。在竞争试验中，将26S与Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VS（选择性蛋白酶体荧光探针）（5μmol·L－1）在 37℃共孵育 1 h，蛋白变性后，用质量分数12.5%SDS-PAGE分离β催化亚基。在凝胶成像仪上观察胶内带荧光蛋白条带。

1.6 蛋白免疫印迹分析 MCF-7细胞接种于培养瓶内，用25 nmol·L－1的YSY01A分别处理细胞6、12、18、24、36 h，用 PBS洗涤细胞2次，收集细胞后，用全蛋白裂解液4℃裂解细胞，12 000 r·min－1离心，取上清，BCA法测定蛋白含量，加入双蒸水和loading buffer配制成相同浓度的蛋白样品，100℃煮沸5 min变性。－80℃储存。等量的蛋白样品进行质量分数为10%SDS-PAGE分离，将蛋白转移到NC膜上，封闭1 h，一抗（ubiquitin、PARP、NF-κB、IκBα、P-IκBα、Bax、Bcl-xL、XIAP、wt-p53、puma、endonuclease G、GAPDH）4℃孵育过夜。TBST漂洗，二抗（1∶10 000）孵育 1 h，TBST漂洗，用 ECL染膜 1 min，暗室中曝光于X胶片上。

1.7 细胞增殖测定 1×104个MCF-7细胞接种于96孔板小孔内，YSY01A和 PS341（12.5、25、50、75、100、200 nmol·L－1）分别处理细胞 48 h。另外接种相同数量的细胞于96孔板小孔内，用YSY01A（12.5、25、50、75、100、200 nmol·L－1）处理肿瘤细胞（MCF-7或MDA-MB-435S或Bcap37细胞）48 h。采用SRB法检测细胞存活。

1.8 细胞凋亡检测 1×106个MCF-7细胞接种于大培养瓶内，用150 nmol·L－1的YSY01A处理细胞8、12、24 h后，PBS洗涤细胞，收集细胞。用 Blocking buffer悬浮细胞，AnnexinV-FITC与细胞室温共孵育15 min，流式细胞仪检测前5 min加入PI，然后检测细胞状态。

1．9 线粒体膜电位（MMP）测定 1×106个MCF-7细胞接种于大培养瓶内，用 YSY01A（12.5、25、50、75、100、200 nmol·L－1）处理细胞8 h，用无血清培养基洗涤细胞，并收集细胞。10 mmol·L－1的JC-1（用无血清培养基作为稀释液）与细胞在37℃培养箱内孵育30 min，PBS漂洗后，流式细胞仪检测。1.10 数据分析 实验数据用¯x±s表示，用SAS软件处理数据，方差分析考察统计学意义。

Fig 2 Inhibitory effects of YSY01A on proteasome activity

2 结果

2.1 蛋白酶体抑制作用 细胞外蛋白酶体活性结果（Fig 2A）可看出YSY01A抑制CT-L、T-L和PGPH的活性，且对CT-L活性的抑制作用最强。实验测得的YSY01A对 CT-L、T-L和 PGPH的 IC50值分别为（138.77±7.28）、（1328.94±146.02）、（716.39±72.31）nmol·L－1，其中 YSY01A抑制 T-L的作用比PS341强4倍，而对另外两个催化位点的作用，YSY01A弱1～2倍。且YSY01A抑制MCF-7细胞内的蛋白酶体活性（Fig 2B），其抑制特点同细胞外结果一致。通过分析蛋白酶体活性谱（Fig 2C），发现 YSY01A能与 β5／β5i（CT-L活性）、β2／β2i（T-L活性）、β1／β1i（PGPH活性）结合，其结合能力和抑制作用一致。蛋白免疫印迹结果显示（Fig 2D），YSY01A能使细胞内泛素蛋白表达增加，表明该化合物抑制了蛋白酶体后使得泛素蛋白降解减少，从而出现堆积。这些结果都证实YSY01A是蛋白酶体抑制剂。

2.2 肿瘤细胞增殖抑制作用 虽然YSY01A是PS341同类物，但由于对蛋白酶体催化亚基选择性不同，所以该化合物的抗肿瘤活性被检测。12.5～200 nmol·L－1的 YSY01A和PS341均有明显抑制MCF-7细胞增殖作用（Fig 3A），而且它们抑制细胞的 IC50分别为（42.5±4.5）和（57.1±0.8）nmol·L－1。另外YSY01A也不同程度地抑制另外两种乳腺癌细胞增殖（Fig 3B），其对 MDA-MB-435S和Bcap37细胞的 IC50分别为（71.5±5.2）、（878.6±18.2）nmol·L－1。由结果可知，MCF-7细胞不仅对YSY01A最敏感，而且在小于100 nmol·L－1时比对PS341敏感性强。

Fig 3 Proliferative inhibitory effects of YSY01A on cancer cells

2.3 诱导细胞凋亡 YSY01A（150 nmol·L－1）作用MCF-7细胞8、12、24 h后，均出现细胞凋亡（Fig 4A）。结果显示，YSY01A能引起细胞早期和晚期凋亡，细胞凋亡率分别为14.83%±1.30%、18.49%±2.71%、27.59%±1.39%，与对照组比较，差异均有显著性（P＜0.05）。50 nmol·L－1的 YSY01A作用细胞12 h时（Fig 4B），全长PARP蛋白表达减少，而断裂的PARP部分增加，表明细胞出现凋亡，且随时间延长，细胞凋亡明显增加。

2．4 NF-κB通路 大多数蛋白酶体抑制剂的抗肿瘤作用都与NF-κB通路有密切关系。YSY01A具有抑制蛋白酶体的活性，考察了YSY01A对NF-κB系统的影响，结果如图（Fig 4C），50 nmol·L－1的YSY01A作用细胞2～24 h，P-IκBα呈现明显的时间依赖性增加，而I-κBα则呈现时间依赖性减少，但细胞内NF-κB没有明显变化。

Fig 4 Effects of YSY01A on apoptosis and NF-κB pathway

2.5 线粒体膜电位降低 线粒体是细胞凋亡的核心部位，不管是外源性还是内源性的凋亡最终都经线粒体途径诱导细胞凋亡，因此YSY01A对线粒体膜电位的影响首先被检测（Fig 5A）。结果显示，12.5～200 nmol·L－1的 YSY01A能使 MCF-7细胞内JC-1单体增加，表明线粒体膜电位下降；与对照组相比，膜电位下降的细胞数增加了7.5% ～22.5%，而且呈浓度依赖性。检测了线粒体相关蛋白的表达（Fig 5B），结果显示，随着YSY01A浓度的升高，MCF-7细胞内的Bax蛋白表达增加，Bcl-xL蛋白表达减少，而两者的比值明显增大。凋亡抑制分子XIAP表达没有明显变化，但wt-p53和其调节的puma蛋白表达明显增加。

Fig 5 Effects of YSY01A on mitochondrial pathway

3 讨论

蛋白酶体抑制剂已经成为重要的抗肿瘤药。虽然PS341抗瘤谱广，抑制肿瘤生长作用强，但因其严重的不良反应使得该药物在肿瘤治疗方面受到限制。因此发现新蛋白酶体抑制剂成为抗肿瘤研究热点之一。

本研究选用3种乳腺癌细胞，通过考察YSY01A对细胞增殖抑制的作用，发现该化合物在纳摩水平就能明显抑制MCF-7细胞的增殖。因此本研究以MCF-7细胞为模型，研究了YSY01A的抗癌机制及对蛋白酶体活性的影响。研究结果表明YSY01A能抑制MCF-7细胞中蛋白酶体的3个催化亚基，而且对CT-L的抑制作用最强，其次是PGPH，虽然对T-L的作用较弱，但比PS341作用强4倍。通过蛋白酶体活性谱的研究，发现YSY01A能与β5、β5i、β1、β1i、β2和 β2i活性位点结合，而 PS341则阻碍 β5、β5i、β1、β1i和 β2i位点［2］。这些结果证明YSY01A对蛋白酶体的选择性与PS341不同。

蛋白酶体抑制剂的细胞毒性与抑制CT-L、T-L、PGPH活性有密切关系。一般蛋白酶体抑制剂抑制CT-L和T-L或PGPH就具有很强细胞毒作用，但如果3个活性位点都被抑制，使化合物的活性会进一步增加［7］。本实验结果也证明了这一点，YSY01A抑制MCF-7细胞增殖的作用比PS341的作用强；在MCF-7、Bcap37和 MDA-MB-435S 3种乳腺癌细胞中，YSY01A的抑制MCF-7细胞增殖作用最强。

细胞凋亡是细胞程序化死亡，主要包括外源性（死亡受体通路）和内源性凋亡途径（线粒体途径）。本研究证实YSY01A是通过线粒体途径诱导细胞凋亡。除了经典的凋亡途径外，还有其他一些细胞因子会调节细胞凋亡。Puma是被p53调节的线粒体膜蛋白，促进细胞色素C释放［8］。XIAP凋亡抑制蛋白是IAP家族中最强的凋亡抑制因子。当凋亡发生时，线粒体膜孔开放，Cytochrome C、Endonuclearse G和AIF从线粒体中释放到胞质内，Cytochrome C可以激活下游的Caspases蛋白，导致PARP断裂，损伤DNA诱导凋亡。Endonuclearse G则转入细胞核内促发DNA片段化［9］。本研究结果表明YSY01A能诱导细胞凋亡，通过抑制蛋白酶体活性，导致细胞内的wt-p53增加，并进一步激活线粒体膜上的puma蛋白，同时使Bcl-xL减少，而Bax增加，导致膜电位下降，膜孔开放，释放 Endonuclearse G，而且PARP被激活，最终引起凋亡。

细胞凋亡是一个非常复杂的过程，也受很多通路的调节。有研究证实PS341通过NF-κB诱导细胞凋亡，而且和自噬也有关系［10－12］。理论上讲，YSY01A抑制蛋白酶体活性，造成P-IκBα的表达增加，应该引起IκBα蛋白表达增加，但却使其表达下降，这可能跟 IκBα其他调节途径有关。然而YSY01A对乳腺癌细胞中NF-κB没有影响，该结果表明YSY01A可能不从NF-κB蛋白水平调节凋亡。另外，YSY01A是否激活死亡受体通路，是否引发自噬也需进一步研究探讨。

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